Yazarlar, enfeksiyon deneylerinde teknik yardım için Lynne Foster'a, SEM'e erişim için Washington Üniversitesi Selül Görüntüleme Merkezi'nden (WUCCI) James Fitzpatrick'e, UTI89kanR UPEC suşu için Scott Hultgren'e ve makalenin eleştirel okuması için David Hunstad'a teşekkür ediyor.
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (VPO#DGE - 1143954 Lisansüstü Araştırma Bursu), Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Bulaşıcı Hastalıkları Araştırma Merkezi (NMG'ye Pilot Araştırma Ödülü), Amerikan Kalp Derneği: #12POST12050583 (NMG) ve #14POST20020011 (NMG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, NIAID: R01 AI114635 (ALL) ve NIDDK tarafından desteklenmiştir: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, proje II PI:ALL) ve K01 DK110225-01A1 (NMG). Hayvan çalışmalarının bir kısmı NCRR hibesi C06 RR015502 tarafından desteklenen bir tesiste gerçekleştirilmiştir. Washington Üniversitesi Hücresel Görüntüleme Merkezi (WUCCI; SEM'in yapıldığı yer) ve MSJ, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, Washington Üniversitesi Çocuk Keşif Enstitüsü ve St. Louis Çocuk Hastanesi (CDI-CORE-2015-505), Barnes-Yahudi Hastanesi Vakfı (3770) ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NS086741) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Yazarlar bu çalışma ile ilgili çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Birincil İYE fazı sırasında UPEC bakteriürisini temizlememiş fareleri tanımlamak için bu modeldeki ilk kritik adım. Bu fareler, G. vaginalis'e maruz kaldıktan sonra UPEC bakteriüri oranlarını karıştıracakları için deneyden çıkarılmalıdır. İlk UPEC aşılamasından sonra, bakteriyel klirensi izlemek için haftalık olarak idrar toplanmalıdır. C57BL / 6 farelerinin yaklaşık% 65-80'i 4 hafta içinde bir İYE89kanR enfeksiyonunu temizleyecektir. Diğer inbred fare suşları, UPEC klirensi42,43 ve rezervuar oluşumu için farklı eğilimlere sahiptir ve bu nedenle bu model için uygun olmayabilir. İkinci kritik nokta, ampirik çalışmaların, sadece PBS'ye maruz kalan kontrol farelerinde meydana gelen arka plan spontan ortaya çıkışının üzerinde önemli rezervuar ortaya çıkışını tetiklemek için iki ardışık G. vaginalis aşısının (12 saat veya 1 wk arayla) gerekli olduğunu belirlemesidir. İki ardışık maruziyet arasındaki diğer süreler test edilmemiştir, ancak benzer sonuçlar verebilir. UPEC mesane titrelerinde bir azalmanın sadece G. vajinalis maruziyetlerinin39 wk arayla 1 wk verildiği modelde gözlendiğini belirtmek önemlidir. İkiden fazla maruziyet uygulanabilirken, ampirik kanıtlar tek başına tekrarlanan kateterizasyonun ortaya çıkışı arttırdığını, bu da sonuçların yorumlanmasını karıştırabileceğini veya maruz kalma grupları ve kontroller arasındaki farklılıkları ayırt etmek için daha fazla sayıda hayvan gerektirebileceğini göstermektedir. Son olarak, in situ mesane fiksasyon yönteminin birkaç kritik adımı vardır. Fiksatifin kelepçeli mesanelerin içinde kalmasını sağlamak için bazı beceriler gereklidir. Sönük mesanelerin SEM tarafından görüntülenmesi daha zor olacaktır. Fiksatifin mesaneye aşılanması sırasında çok nazik olmak da önemlidir, çünkü ürotelyumun fiksatif içeren kateter ile kazınması, G. vaginalis tarafından tetiklenenlerden bağımsız olarak ürotelyal pul pul dökülmeye neden olabilir. Fiksatif kokteylde belirtilen tüm konsantrasyonlar nihai konsantrasyonlardır. Bunların yanlış oranları, hücrelerin yetersiz sabitlenmesine ve şişmesine veya büzülmesine neden olabilir. Fiksatörler, hücrelerde ve dokularda sıcaklık şokunu önlemek için fizyolojik sıcaklıklara ısıtılmalıdır. Isınma ayrıca fiksatiflerin plazma membranlarından difüzyon hızında hafif bir iyileşme sağlar. SEM analizi için hazırlanan numuneler için osmiyum boyama sıklıkla ihmal edilebilirken, bu protokolde lipitleri stabilize etmek ve kritik nokta kurutma sırasında hücresel membranların çatlamasını önlemek için önemli bir adımdır.
Bu protokol, diğer UPEC ve / veya G. vaginalis suşlarını sırasıyla rezervuar oluşturma ve ortaya çıkmalarını tetikleme yetenekleri açısından test etmek için değiştirilebilir. Diğer vajinal bakterilere (örneğin, Lactobacillus crispatus PVAS100) maruz kalma veya ısıda öldürülen G. vaginalis, hiçbiri bu modelde patoloji göstermeyen diğer deneysel faktörler de eklenebilir39. Test edilecek diğer bakteri suşlarını seçerken, tüm deneylerde standart bir inokülum konsantrasyonunun kullanılabileceği şekilde tutarlı bir büyüme göstermek önemlidir. JCP8151BSmR'nin büyümesi anaerobik bir odada optimize edilmiştir. Bu suş muhtemelen anaerobik bir GasPak sisteminde yetiştirilebilir, ancak bu, sağlam bakteri büyümesini sağlamak için optimizasyon gerektirir. Son olarak, modeldeki belirli adımların zamanlamasını değiştirmek mümkün olabilir. Örneğin, CFU veya konakçı yanıtlarını izlemek için idrar, UPEC rezervuar oluşum aşamasında daha erken zaman noktalarında toplanabilir. Bu modelde, erken zaman noktalarında (3, 6, 12 hpi) idrar örneklerinin toplanmasının enfeksiyonun ilerlemesi veya rezervuarların kurulması üzerinde olumsuz bir etkisi gözlenmemiştir. UPEC rezervuarlarının ortaya çıkışının, 12 saat veya 1 wk verilen iki JCP8151BSmR dozundan sonra meydana geldiği bildirilmiştir, ancak diğer zaman aralıkları henüz test edilmemiştir. Ayrıca, UPEC rezervuar oluşum aşamasını 2 haftaya (4 hafta yerine) düşürerek modelin toplam süresini azaltmak da mümkün olabilir, çünkü farelerin çoğu bu zamana kadar bakteriüriyi temizler. Mesanenin kimyasal eksfoliyantlara maruz kalmasını takiben UPEC ortaya çıkışını inceleyen önceki çalışmalarda 1 veya 2 wk UPEC rezervuar oluşum fazı17,18 kullanılmıştır. Bununla birlikte, UPEC bakteriüri temizliği için gereken süreyi azaltmak, deneyden daha fazla hayvanın itlaf edilmesini gerektirme pahasına olabilir. Son olarak, mesanenin SEM analizi, G. vajinalis'in ürotelyum üzerindeki etkisinin süresini gözlemlemek için ek zaman noktalarında yapılabilir.
Sorun giderme ile ilgili olarak, özellikle mesane SEM analizi ile ilgili bazı önemli hususlar vardır. Kullanılan fare arka planına ve mevcut inflamasyon miktarına bağlı olarak, bazı mesaneler çok ince duvarlarla ortaya çıkacaktır. Bu mesaneler kritik nokta kurutma sırasında daha fazla kıvrılma eğilimindedir ve kovan kabuğu benzeri bir şekle neden olabilir. Bu meydana gelirse, en iyi yöntem, kabuk şeklindeki mesaneyi kıvrılmış arayüz boyunca ikiye bölmek ve daha sonra çıkıntılı dokunun kütlesini çıkarmak için ikinci kez kesmektir. Kesim, PTFE kaplamalı çift kenarlı tıraş bıçağı ile en iyi şekilde çalışır. Aşırı yağ bazen osmiyum boyama adımları sırasında çözünebilir. Bu, durulama ve dehidrasyon adımları sırasında yıkanamayan ve sonraki kurutma sırasında mesane yüzeyine yerleşebilen istenmeyen çözünmez yağ damlacıklarına neden olabilir. Bu damlacıklar, numunenin üzerine dağılmış küçük küreler veya disk benzeri yapılar olarak görünebilir (Şekil 4D). Bu, mesanenin etrafından mümkün olduğunca fazla yağ dokusunun çıkarılmasını sağlayarak hafifletilebilir. Platinum, iridyum kaplama ile değiştirilebilir, ancak ince yapısal detayların maskelenmesini azaltmak için kalınlıklar minimumda tutulmalıdır. Kaplama sırasında dönen bir aşamanın kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Bu modelin bir sınırlaması, çok sayıda fare gerektirmesidir. C57BL/6 farelerinin sadece% 65-80'i UPEC bakteriürilerini temizleyecek ve sonraki G. vaginalis veya PBS aşılaması için uygun olacaktır (bkz. Şekil 2C). Grup başına 10-12 fare elde etmek için (G. vaginalis inoculation vs. PBS), ~ 30 fare başlangıçta UPEC ile enfekte edilmelidir. Ayrıca, istatistiksel anlamlılığı tespit etmek için gerekli biyolojik kopyaları elde etmek için muhtemelen birden fazla deney gereklidir. Maruziyetler 1 wk arayla verildiğinde, PBS'ye maruz kalan farelerin% 14'ünde UPEC ortaya çıkışı meydana geldi (Şekil 3B). Bu nedenle, G. vaginalis'e maruz kalan farelerde PBS kontrollerine göre (0.8'de güç; alfa = 0.05 [tek taraflı]) UPEC rUTI'sinde önemli bir artış tespit etmek, her maruz kalma grubu için kümülatif olarak en az 40 farenin test edilmesini gerektirir. Ek bir husus, bu deneylerin pahalı ve emek yoğun olmasıdır. Fareler UPEC klerensi için haftalık olarak izlenmelidir ve deneysel zaman seyri, G. vajinalis 12 saatlik bir zaman diliminde iki kez mi yoksa iki kez 1 wk aralıklarla mı verildiğine bağlı olarak 4-5 wk'dır. SEM emek yoğundur ve mikroskop kullanılabilirliğine ve servis ücretlerine bağlı olarak maliyetli olabilir. Tüm mesanenin SEM için hazırlanması, analiz için bol miktarda materyal sağlar, ancak dezavantajı, her mesanenin analiz edilmesinin zaman alıcı olabileceğidir. Bu nedenle, idrar ve doku titreleri için kullanılan daha yüksek hayvan sayılarına kıyasla SEM tarafından sadece sınırlı sayıda mesanenin analiz edilebilmesi muhtemeldir. Ek olarak, mesane "bardaklarının" kavisli yüzeylerinin yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek, görünürlüğü engelleyebilecek gölgeler nedeniyle beceri gerektirir. Mesane SEM, ürotelyal peelingi görselleştirmek için yararlı bir araç olmasına rağmen, bu yöntem büyük ölçüde nitelikseldir. Numune yuvarlak bir şekilde sabitlendiğinden ve fiksatifte glutaraldehit kullanımı nedeniyle, ışık mikroskobu yoluyla floresan olarak eksprese eden bakterilerin taranması mümkün değildir. İmmün boyama ve kimyasal boyalar, çoğu antijeni ve ozmiyumu çapraz bağlayacak ve antijen bölgelerini maskeleyecek ve dokuyu koyulaştıracak glutaraldehit kullanımı nedeniyle bu işlemle uyumlu değildir. Bununla birlikte, SEM tekniği, hücre boyutu48,49 gibi ek problar kullanılmadan nicel olarak değerlendirilebilen parametreler için yararlıdır.
Bu model, daha önce açıklanan yöntemlerin ötesinde çeşitli avantajlar sunar. Mesanenin dış kaynaklı olarak yeniden sokulmasının aksine, mesane rezervuarlarından çıkmanın neden olduğu UPEC rUTI mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Mesane rezervuarlarından ortaya çıkan diğer rUTI modelleri, ürotelyal pul pul dökülmeye neden olmak için kimyasal ajanlar (protamin sülfat veya kitosan) kullanır17,18, bu da kadınlarda rİYE'nin tetikleyicisi olmayacaktır. G. vaginalis, bazı kadınlarda kateterizasyon veya suprapubik aspirasyon yoluyla doğrudan mesaneden toplanan idrarda saptanan yaygın bir ürogenital bakteridir23,26. Bu gerçek, BV (G. vajinalis'in vajinada aşırı büyüdüğü yer) ve İYE arasındaki bilinen ilişki ile birleştiğinde, G. vajinalis'in rİYE'nin klinik olarak makul bir tetikleyicisi olduğunu göstermektedir. Son olarak, in situ mesane fiksasyon yöntemi, mesane ultrayapısını korur ve hasarı sınırlayarak mesane tabakalarının birbirinden ayrılmamasını sağlar. Ürotelyumu görselleştirmek için önceki yöntemler geleneksel olarak kullanıcının gerilmiş mesaneyi fiksatif48'e batırmadan önce mesaneyi aseptik olarak hasat etmesini, ikiye bölerek, germesini ve bir diseksiyon tepsisine sabitlemesini sağlar. Bu yöntem çok düz bir numune ile sonuçlanır, ancak dokunun eşit veya doğal gerilmesini sağlamaz ve gerilmiş ve gerilmiş (yüksek buruşuk doku ile sonuçlanan) alanlara neden olabilir ve mesane tabakasının ayrılmasına neden olabilir. Ek olarak, mesanenin dokuyu germek ve sabitlemek için bu fiziksel manipülasyonları, ürotelyal pul pul dökülme de dahil olmak üzere hasara neden olabilir. Başka bir yöntem, parafine gömülmeden ve bir mikrotom ile ince kesitler elde etmeden önce sağlam mesaneleri fiksatif olarak batırmaktır. İnce kesitler, bakterileri incelemek ve protein lokalizasyonunu barındırmak için immünohistokimya deneyleri için paha biçilmezdir, ancak ince bir kesit ürotelyal yüzeyin görselleştirilmesine izin vermez. Bu SEM yöntemi, tüm mesanenin yüzeyinin bir kerede incelenmesini sağlar.
Açıklandığı gibi, bu modelin gelecekteki uygulamaları, hücre içi rezervuarlar oluşturup oluşturmadıklarını belirlemek için diğer UPEC suşlarının test edilmesini ve pul pul dökülmeye neden olup olmadıklarını değerlendirmek için diğer G. vaginalis suşlarının test edilmesini ve rİYE'ye neden olmak için UPEC ortaya çıkışını içerir. C57BL / 6 farelerin ötesindeki diğer fare suşları da test edilebilir, ancak kronik sistit geliştirme eğilimi yüksek olan fareler (C3H arka planındaki fareler gibi) önerilmez, çünkü deneyden çok fazla farenin toplanması gerekir. C57BL / 6 farelerinin ek bir avantajı, birçok genetik nakavt suşunun ticari olarak temin edilebilmesidir. Bu tür suşlar, rezervuar oluşumunda ve / veya ortaya çıkmasında rol oynayan konakçı faktörleri sorgulamak için bir fırsat sağlar.

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) dünya çapında önemli bir sağlık yükü getirmekte ve her yıl milyonlarca insanın, özellikle de kadınların yaşam kalitesini etkilemektedir1. Üropatojenik Escherichia coli (UPEC) İYE1'in en sık nedenidir. İYE gelişen birçok hasta (yaklaşık% 20-30), ilk enfeksiyonun antibiyotik aracılı temizlenmesine rağmen 6 ay içinde tekrarlayan bir İYE (rİYE) yaşayacaktır2. Ne yazık ki, menopoz öncesi kadınların% 5'iher yıl 3,4 veya daha fazla rİYE'den muzdariptir. Sıralı rUE atakları, indeks vakası 5,6,7,8'den aynı UPEC suşunun kalıcılığından kaynaklanabilir. İnsan örneklerinden ve fare modellerinden elde edilen veriler, aynı suş rİTI'sinin mesanedeki sessiz rezervuarlarda bulunan UPEC'den kaynaklanabileceğini düşündürmektedir. İnsanlarda, UTEC epitel hücrelerinde ve İYE 9,10,11,12,13 hastalarının mesane biyopsilerinde tespit edildi. C57BL / 6 farelerde yapılan çalışmalar, bazı UPEC suşlarının, floresan mikroskobu ve mesane dokusunun homojenizasyonu ve kültürü ile tespit edildiği gibi, mesanede sessiz hücre içi rezervuarlar oluşturabileceğini göstermiştir ve bakteriüri 14,15,16'nın çözülmesini takiben aylarca korunur. Mesanenin, mesane epitelinin (ürotelyum) pul pul dökülmesine neden olan ajanlarla tedavisi, örneğin protamin sülfat17 veya kitosan18, rİYE'ye neden olmak için rezervuarlardan UPEC'in ortaya çıkmasını tetikler. Bu veriler, önceki bir enfeksiyondan mesane UPEC rezervuarlarını barındıran kadınlarda, ürotelyal pul pul dökülmeye yol açan mesane maruziyetlerinin rİYE'yi tetikleyebileceğini düşündürmektedir.
Vajinal mikrobiyotanın idrar yolu enfeksiyonuna katkıda bulunduğuna dair kanıtlar artmaktadır19,20. Gardnerella vaginalis, hem vajinal hem de üriner mikrobiyota 21,22,23,24,25,26,27,28,29'un sık görülen bir üyesidir. Vajinada, yüksek düzeyde G. vajinalis varlığı, bakteriyel vajinozis (BV) olarak bilinen ve kadınların ~% 30'unu etkileyen mikrobiyoz disbiyozu ile ilişkilidir30,31,32. BV'li kadınlar, Lactobacillus33,34,35,36,37'nin hakim olduğu vajinal topluluğa sahip kadınlara kıyasla İYE yaşama riski daha yüksektir. Fare modellerinde, G. vaginalis, hem vajina38'de hem de mesane39'da epitel pul pul dökülmesine neden olur. UPEC mesane rezervuarlarını barındıran C57BL / 6 farelerde, G. vaginalis'e iki ardışık mesane maruziyeti - ancak PBS'ye değil - UPEC'in rezervuarlardan yeniden ortaya çıkmasına neden olur ve UPEC rUTI'ye neden olur. Ortaya çıkış, daha önce UPEC bakteriürisini çözmüş farelerden idrarda UPEC titrelerinin ortaya çıkması ve PBS'ye maruz kalan kontrol hayvanlarına kıyasla kurban sırasında UPEC mesane homojenat titrelerinde daha sonra bir azalma ile kanıtlanmıştır39. İlginçtir ki, mesanede G. vaginalis tarafından kalıcı bir kolonizasyon yoktur. Vakaların büyük çoğunluğunda, her biri idrarda 12 (h)'den az canlı G. vaginalis'e sahip iki kısa maruziyet, ürotelyal peelingi ortaya çıkarmak ve rİYE'yi teşvik etmek için yeterlidir.
Bu protokol, hücre içi mesane rezervuarlarında bulunan UPEC'in neden olduğu bir fare rUE modelini tanımlar ve nüksetmeyi tetiklemek için G. vaginalis mesane aşılamasını kullanır. Bu modelle elde edilen ilerleme, G. vajinalis'in daha önce kullanılan kimyasal ajanlara kıyasla rİYE'nin klinik olarak ilgili bir biyolojik tetikleyicisi olmasıdır. Ayrıca, fare idrar yollarında G. vaginalis'in nispeten kısa ömürlü sağkalımı, cinsel aktiviteden sonra ortaya çıkabileceği gibi, geçici mikrobiyal maruziyetlerin ürotelyum üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. rUTI modelini özetlemenin yanı sıra, bu protokol ayrıca idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile ürotelyumun görüntülenmesi için yöntemleri de açıklamaktadır.
G. vajinalis kaynaklı tekrarlayan UPEC UTI'nin bu protokolü, bir kanamisin direnç kaseti (UTI89kanR)40 taşıyan UPEC suşu UTI89'u kullanır. Test edilen tüm UPEC suşları, farelerde akut enfeksiyon aşamasında hücre içi bakteri toplulukları oluşturamamıştır41 ve UPEC'in tüm suşlarının gizli hücre içi rezervuarlar oluşturma yeteneğine sahip olup olmadığı henüz bilinmemektedir. Modeldeki diğer UPEC suşları kullanılmadan önce rezervuar oluşumu doğrulanmalıdır. Bu protokol spontan streptomisin'e dirençli G. vaginalis izolatı JCP8151BSmR38 kullanır. JCP8151BSmR ile rUTI'nin indüklenmesi,39 saat arayla 12 saat veya 7 gün (d) verilen iki ardışık G. vajinalis aşılaması gerektirir. Diğer G. vaginalis suşlarının peeling ve / veya UPEC rİTI'ye neden olup olmadığı bu modelle belirlenmeye devam etmektedir. Bilinen antibiyotik direncine sahip UPEC ve G. vaginalis suşlarının (UPEC için kanamisin veya spektinomisin ve G. vaginalis için streptomisin gibi) kullanılması esastır, çünkü antibiyotikler, enfeksiyonu izlemek için koloni oluşturan birimlerin (CFU) numaralandırılmasına müdahale edebilecek endojen fare mikrobiyotasının büyümesini önlemek için agar plakalarına eklenebilir. Bu özellikle idrar örneklerinin kültürlenmesi için önemlidir, çünkü fare idrarı sıklıkla antibiyotiksiz kültür plakalarında aşırı büyüyebilen diğer bakterileri içerir. Bu endojen bakterilerin fare idrarındaki kökeni bilinmemektedir, ancak muhtemelen idrar toplama sırasında toplanan periüretral ve ürogenital bakterileri yansıtmaktadır.
G. vaginalis, fakültatif bir anaerobik bakteridir ve bu nedenle, bu protokol anaerobik bir odada büyüyen G. vaginalis JCP8151BSmR'yi tanımlar. Bir anaerobik hazne mevcut değilse, anaerobik büyüme koşullarını korumak için diğer yöntemler (hava geçirmez bir kaptaki GasPak torbası gibi) kullanılabilir. Alternatif olarak, bazı G. vaginalis suşları (JCP8151BSmR dahil) standart bir doku kültürü inkübatöründe (% 5 CO2) büyüyecektir. JCP8151BSmR dışındaki G. vaginalis suşlarının kullanılması, bakterilerin bu modelde benzer şekilde davrandığından emin olmak için test yapılmasını gerektirdiği gibi, değişen büyüme koşulları, istenen canlı inokülum konsantrasyonlarını elde etmek için kültür (plakalar ve sıvı içinde) ve optik yoğunluk (OD) 600 eşdeğerleri için ideal sürelerin ampirik olarak belirlenmesini gerektirir. Ayrıca, büyüme koşullarının G. vaginalis'in patobiyolojisini etkileyip etkilemediği bilinmemektedir.
Son olarak, bu modelin kullanılıp kullanılmayacağını düşünürken, araştırmacılar grup başına tipik İYE fare modellerinden daha fazla sayıda hayvan gerektirebileceğinin farkında olmalıdır. Bu kısmen, rUTI'nin indüklenmesinin, farelerin mesanenin ilk enfeksiyonunun neden olduğu UPEC bakteriürisini çözmesini gerektirmesidir. Bu nedenle, bakteriüriyi temizleyemeyen herhangi bir fare (genellikle devam eden böbrek enfeksiyonunun göstergesi olan bir fenotip), protokolün rUTI fazına dahil edilmez. Bu çalışmalara güç vermek için gereken farelerin sayısı, idrara "kendiliğinden" UPEC ortaya çıkma oranından da etkilenir (ortalama %12-14). Son olarak, farklı fare suşları, hücre içi rezervuar oluşumuna karşı kronik bakteriüri geliştirme eğilimine sahiptir42,43. Bu modelde C57BL/6 dışındaki fare suşları kullanılıyorsa, hayvanların sessiz UPEC hücre içi rezervuarlar geliştirdiği doğrulanmalıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

Üropatojenik Escherichia coli'nin (UPEC) neden olduğu tekrarlayan üriner sistem enfeksiyonları (rİYE) yaygın ve maliyetlidir. Erkek ve dişi farelerde İYE modellerini açıklayan önceki makaleler, idrar ve dokularda bakteriyel aşılama ve numaralandırma prosedürlerini göstermiştir. C57BL / 6 farelerde ilk mesane enfeksiyonu sırasında, UPEC, mesane epitel hücrelerinin içinde, UPEC bakteriürisinin temizlenmesini takiben devam eden gizli rezervuarlar oluşturur. Bu model, UPEC'in gizli mesane rezervuarlarının içinden ortaya çıkmasının neden olduğu rİYE'yi incelemek için bu çalışmalara dayanmaktadır. Ürogenital bakteri Gardnerella vaginalis, bu modelde rİYE'nin tetikleyicisi olarak kullanılır, çünkü kadınların ürogenital yollarında, özellikle İYE ile ilişkili vajinal dysbiosis bağlamında sıklıkla bulunur. Ek olarak, mesane dokusunun taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizini takiben in situ mesane fiksasyonu için bir yöntem de tanımlanmıştır ve mesaneyi içeren diğer çalışmalara potansiyel olarak uygulanmaktadır.

Aşılamayı takiben, idrarda UPEC titreleri saptanabilir (Şekil 2B). İdrar örneklerinin kanamisin içeren seçici ortamlar üzerinde plakalanmaması, muhtemelen idrarı kirleten endojen fare mikrobiyotasının aşırı büyümesine neden olacaktır. UPEC bakteriüri seviyesi muhtemelen 1. günde yüksek olacaktır ve daha sonraki zaman noktalarında azalmadan önce ilk hafta boyunca artabilir (Şekil 2C). Farelerin yaklaşık% 65-80'inde idrarda 28 dpi ile saptanabilir UPEC olmayacaktır (Şekil 2C, yeşil daire). Bu fareler modelin sonraki adımlarında kullanılabilir. Bakteriyik kalan fareler (Şekil 2C, kırmızı elips) deneyden çıkarılmalıdır.
12 saat (Şekil 3A) veya 1 wk aralıkla verilen iki ardışık G. vaginalis maruziyeti (Şekil 3B), tekrarlayan bakteriüriye neden olmak için hücre içi rezervuarlardan UPEC'in ortaya çıkmasına neden olur. Hem UPEC bakteriüri seviyesi (Mann-Whitney testi) hem de UPEC rUTI (Fisher'ın kesin testi) gösteren farelerin fraksiyonu, PBS kontrol grubuna kıyasla G. vajinalise maruz kalan farelerde anlamlı derecede yüksektir. İdrar sitolojisi analizi, UPEC ortaya çıkışını gösteren G. vaginalis'e maruz kalan farelerden idrardaki PMN'leri tespit eder (Şekil 3C). 1 wk arayla verilen iki maruziyetli modelde, mesane dokusundaki UPEC titreleri, muhtemelen UPEC'in rezervuarlardan ortaya çıkması ve daha sonra temizlenmesi nedeniyle, PBS'ye kıyasla G. vajinalise maruz kalan farelerde daha düşüktür (Şekil 3D).
In situ sabit mesane dokusunun SEM ile görselleştirilmesi, sadece PBS'ye maruz kalan kontrol farelerinde mesane yüzeyini kaplayan büyük yüzeysel şemsiye ürotelyal hücreleri ortaya koymaktadır (Şekil 4A). Ürotelyal peeling, yüzeysel şemsiye hücrelerinin kaybı ile kanıtlanmıştır ve G. vaginalis'e maruz kalan farelerde daha küçük altta yatan transizyonel epitel hücrelerini ortaya çıkarmaktadır (Şekil 4B). Hücre içi rezervuarların kurulması sırasında UPEC aşılamasından erken sonra, UPEC ürotelyum üzerinde görülür ve peeling hücrelerinden filamentlenir (Şekil 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Şekil 2. Faz 1 sırasında idrardaki UPEC titrelerinin izlenmesi (rezervuar oluşumu). (A) Koloni oluşturan birimlerin (CFU) kaplamasının şeması. (B) UPEC titrelerinin idrarda LB + kanamisin üzerindeki temsili görüntüsü. Siyah daireler, CFU / mL'yi hesaplamak için sayılması gereken idrar örneği lekelerini gösterir. (C) C57BL/6 farelerde UPEC bakteriürisinin zaman seyri. Her çizgi, zaman içinde UPEC idrar titrelerini izleyen ayrı bir fareyi temsil eder. Noktalı çizgi, algılama sınırını gösterir (1000 CFU/mL). Kırmızı elips, UPEC bakteriürisini çözemeyen ve bu nedenle G. vaginalis'in neden olduğu rUTI modeli için kullanılmayacak dört fareyi (20 üzerinden) gösterir. Tersine, yeşil daire UPEC bakteriürisini çözen ve sonraki aşamalara ilerleyen fareleri gösterir. (D) C. panelinde grafik oluşturmak için kullanılan veri tablosu Sarı, algılanabilir CFU; yeşil, CFU yok. (E) UPEC CFU'nun artık idrarda tespit edilmediği zaman noktasına göre farelerin maruz kalma gruplarına randomizasyonu ("Gün çözüldü"). Panel D'nin sol sütunundaki fare numaraları, panel E'de verilen fare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">numaralarıyla aynıdır.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Şekil 3. G. vajinalis UPEC rİYE'yi tetikler. PBS (daireler) veya G. vaginalis'e (Gvag; kareler) iki ardışık idrar yolu maruziyetini takiben idrarda UPEC titreleri, 12 saat (A) veya 1 wk (B) aralıklarla verilir. Her sembol ayrı bir fareyi temsil eder. İkinci pozlamayı takiben her fareden 1-3 d arasında tespit edilen en yüksek CFU / mL UPEC çizilir. Saptanabilir bakteriürisi olmayan fareler, tespit sınırında (noktalı çizgi) çizilir. (C) UPEC (ok uçları) ve polimorfonükleer (PMN) hücreleri (oklar) gösteren idrar sitolojisi analizi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D) Mesane dokularındaki UPEC titreleri, 1 wk arayla verilen iki ardışık idrar yolu maruziyetini takiben 3 d topladı. Her sembol farklı bir fareyi temsil eder ve sıfırlar algılama sınırında (noktalı çizgi) çizilir. A, B ve D'de, kutular medyan işaretli ve bıyıkları min'den maksimuma kadar bıyıklarla birinci ve üçüncü çeyrektedir<. ** P < 0,01; P < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Şekil 4. Mesanelerin SEM analizi in situ olarak sabitlenmiştir. Mesaneler, PBS (A) veya G. vaginalis'e (C) iki maruziyetten (12 saat arayla) 3 saat sonra farelerden toplandı. Noktalı çizgiler, G. vajinalise maruz kalan mesanelerde daha küçük olan tek bir idrar epitel hücresini göstermektedir, çünkü büyük yüzeysel hücreler pul pul dökülerek altta yatan transizyonel epiteli ortaya çıkarmıştır. (B) Mesane, UPEC ile ilk aşılamadan 6 saat sonra, modelin 1. Aşaması sırasında, ürotelyal peeling ve hücre dışı UPEC gösterdi. (D) Mesane yüzeyinde bulunan çözünmez yağ damlacıkları örneği. Ölçek çubukları ana görüntülerde 20 μm ve girişte 2 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice at JoVE.com

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Gizli hücre içi mesane rezervuarları oluşturmak için üropatojenik E. coli (UPEC) transüretral aşılamasının bir fare modeli ve tekrarlayan UPEC İYE'yi indüklemek için G. vajinalis'e mesane maruziyeti gösterilmiştir. Ayrıca bakterilerin sayımı, idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu için işlenmesi de gösterilmiştir.

Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

recurrent-escherichia-coli-urinary-tract-infection-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

5.7K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine in Saint Louis. Gizli hücre içi mesane rezervuarları oluşturmak için üropatojenik E. coli (UPEC) transüretral aşılamasının bir fare modeli ve tekrarlayan UPEC İYE'yi indüklemek için G. vajinalis'e mesane maruziyeti gösterilmiştir. Ayrıca bakterilerin sayımı, idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu için işlenmesi de gösterilmiştir.

Video: Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on Luria-Bertani (LB) agar at 37&deg;C in ambient air. UPEC strains grow as yellowish-white translucent colonies on LB agar. Following confirmation of appropriate colony morphology, single colonies are then picked to be cultured in broth. LB broth can be used for most uropathogenic bacterial strains. Two serial, overnight LB broth cultures can be employed to enhance expression of type I pili, a well-defined virulence factor for uropathogenic bacteria. Broth cultures are diluted to the desired concentration in phosphate buffered saline (PBS). Eight to 12 week old female mice are placed under isoflurane anesthesia and transurethrally inoculated with bacteria using polyethylene tubing-covered 30 gauge syringes. Typical inocula, which must be empirically determined for each bacterial/mouse strain combination, are 106 to 108 cfu per mouse in 10 to 50 microliters of PBS. After the desired infection period (one day to several weeks), urine samples and the bladder and both kidneys are harvested. Each organ is minced, placed in PBS, and homogenized in a Blue Bullet homogenizer. Urine and tissue homogenates are serially diluted in PBS and cultured on appropriate agar. The following day, colony forming units are counted.

This video will demonstrate methods to transurethrally induce mouse urinary tract infections and quantify the extent of resulting infections.

Transüretral İndüksiyon Fare İdrar Yolu Enfeksiyonu

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

İdrar yolu enfeksiyonu küçük bir hayvan modeli: erkek ve dişi farelerin transüretral Kateterizasyon

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.