Los autores agradecen a Lynne Foster por la asistencia técnica en experimentos de infección, a James Fitzpatrick en el Centro de Imágenes Celulares de la Universidad de Washington (WUCCI) por el acceso al SEM, a Scott Hultgren por la cepa UTI89kanR UPEC y a David Hunstad por la lectura crítica del manuscrito.
Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), por el Center for Women's Infectious Disease Research de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington (Pilot Research Award to NMG), por la American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) and #14POST20020011 (NMG), y por los Institutos Nacionales de Salud, NIAID: R01 AI114635 (ALL) y NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, proyecto II PI:ALL) y K01 DK110225-01A1 (NMG). Algunos de los estudios en animales se realizaron en una instalación apoyada por la subvención C06 RR015502 del NCRR. El Centro de Imágenes Celulares de la Universidad de Washington (WUCCI; donde se realizó SEM) y MSJ fueron apoyados por la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington, el Instituto de Descubrimiento De Niños de la Universidad de Washington y el Hospital de Niños de St. Louis (CDI-CORE-2015-505), la Fundación para el Hospital Barnes-Jewish (3770) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS086741). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses relacionados con este estudio.

El primer paso crítico en este modelo para identificar ratones que no han eliminado la bacteriuria UPEC durante la fase primaria de ITU. Estos ratones deben ser retirados del experimento, ya que de lo contrario confundirían las tasas de bacteriuria UPEC después de la exposición a G. vaginalis. Después de la inoculación inicial de UPEC, la orina debe recolectarse semanalmente para monitorear el aclaramiento bacteriano. Aproximadamente el 65-80% de los ratones C57BL / 6 eliminarán una infección por UTI89kanR dentro de las 4 semanas. Otras cepas de ratones endogámicos tienen diferentes propensiones para el aclaramiento de UPEC42,43 y la formación de reservorios y, por lo tanto, pueden no ser adecuadas para este modelo. El segundo punto crítico es que los estudios empíricos han determinado que dos inoculaciones secuenciales de G. vaginalis (ya sea a 12 h o 1 semana de distancia) son necesarias para desencadenar una aparición significativa de reservorios por encima de la emergencia espontánea de fondo que ocurre en ratones de control expuestos solo a PBS. No se han probado otras duraciones de tiempo entre las dos exposiciones secuenciales, pero podrían arrojar resultados similares. Es importante tener en cuenta que solo se observó una reducción en los títulos de vejiga de UPEC en el modelo en el que las exposiciones a G. vaginalis se administraron a 1 semana de diferencia39. Si bien se pueden administrar más de dos exposiciones, la evidencia empírica sugiere que el cateterismo repetido por sí solo aumenta la emergencia, lo que puede confundir la interpretación de los resultados o requerir un mayor número de animales para distinguir las diferencias entre los grupos de exposición y los controles. Finalmente, el método de fijación de la vejiga in situ tiene varios pasos críticos. Se requiere cierta habilidad para garantizar que el fijador permanezca dentro de las vejigas sujetas. Las vejigas desinfladas serán más difíciles de visualizar por SEM. También es esencial ser muy suave al inocular el fijador en la vejiga, ya que raspar el urotelio con el catéter que contiene fijador puede inducir la exfoliación urotelial independientemente de lo que desencadena G. vaginalis. Todas las concentraciones mencionadas en el cóctel fijador son concentraciones finales. Las proporciones inadecuadas de estos pueden resultar en una fijación insuficiente e hinchazón o contracción de las células. Los fijadores deben calentarse a temperaturas fisiológicas para evitar el choque de temperatura en las células y los tejidos. El calentamiento también proporciona una ligera mejora en la tasa de difusión de los fijadores a través de las membranas plasmáticas. Si bien la tinción de osmio a menudo se puede omitir para muestras preparadas para el análisis SEM, es un paso esencial en este protocolo para estabilizar los lípidos y prevenir el agrietamiento de las membranas celulares durante el secado en puntos críticos.
Este protocolo puede modificarse para probar otras cepas UPEC y/o G. vaginalis por su capacidad para formar reservorios y desencadenar su aparición, respectivamente. También se pueden agregar otros factores experimentales, como la exposición a otras bacterias vaginales (por ejemplo, Lactobacillus crispatus PVAS100) o G. vaginalis muerta por calor, ninguno de los cuales demuestra patología en este modelo39. Al seleccionar otras cepas bacterianas para probar, es importante demostrar un crecimiento consistente de tal manera que se pueda usar una concentración estándar de inóculo en todos los experimentos. El crecimiento de JCP8151BSmR se ha optimizado en una cámara anaeróbica. Esta cepa probablemente podría cultivarse en un sistema gaspak anaeróbico, pero esto requeriría optimización para garantizar un crecimiento bacteriano robusto. Finalmente, puede ser posible modificar el tiempo de ciertos pasos en el modelo. Por ejemplo, la orina se puede recolectar en puntos de tiempo más tempranos durante la fase de formación del reservorio DE UPEC para monitorear las respuestas de la UFC o del huésped. En este modelo no se ha observado un efecto adverso de la recolección de muestras de orina en puntos de tiempo tempranos (3, 6, 12 hpi) sobre la progresión de la infección o el establecimiento de reservorios. Se ha informado que la aparición de reservorios de UPEC ocurre después de dos dosis de JCP8151BSmR administradas a 12 h o 1 semana, pero aún no se han probado otros intervalos de tiempo. También puede ser posible reducir la duración total del modelo reduciendo la fase de formación del reservorio UPEC a 2 semanas (en lugar de 4 semanas), ya que muchos de los ratones eliminan la bacteriuria en este momento. Estudios previos que examinaron la aparición de UPEC después de la exposición de la vejiga a exfoliantes químicos utilizaron una fase17,18 de formación de reservorios de UPEC de 1 o 2 semanas. Sin embargo, la disminución de la cantidad de tiempo para la eliminación de la bacteriuria UPEC puede tener el costo de requerir que más animales sean sacrificados del experimento. Finalmente, el análisis SEM de la vejiga se puede realizar en puntos de tiempo adicionales para observar la duración del efecto de G. vaginalis en el urotelio.
Con respecto a la solución de problemas, hay algunas consideraciones importantes específicamente con respecto al análisis SEM de la vejiga. Dependiendo del fondo de ratón utilizado y la cantidad de inflamación presente, algunas vejigas se presentarán con paredes muy delgadas. Estas vejigas tienden a curvarse más durante el secado de puntos críticos y pueden dar lugar a una forma de concha de cowrie. Si esto ocurre, el mejor método es cortar la vejiga en forma de concha por la mitad a lo largo de la interfaz rizada y luego una segunda vez para eliminar la mayor parte del tejido colgante. El corte funciona mejor con una cuchilla de afeitar de doble filo recubierta de PTFE. El exceso de grasa a veces puede solubilizarse durante los pasos de tinción de osmio. Esto puede resultar en gotas de grasa insolubles no deseadas que pueden no lavarse durante los pasos de enjuague y deshidratación y que pueden asentarse en la superficie de la vejiga durante el secado posterior. Estas gotas pueden aparecer como pequeñas esferas o estructuras en forma de disco dispersas sobre la muestra (Figura 4D). Esto se puede mitigar asegurando que se elimine la mayor cantidad posible de tejido adiposo de alrededor de la vejiga. El platino puede ser sustituido por el recubrimiento de iridio, pero los espesores deben mantenerse al mínimo para reducir el enmascaramiento de los detalles estructurales finos. El uso de una etapa giratoria durante el recubrimiento es muy recomendable.
Una limitación de este modelo es que requiere un gran número de ratones. Solo el 65-80% de los ratones C57BL/6 eliminarán su bacteriuria UPEC y serán adecuados para la posterior inoculación de G. vaginalis o PBS (ver Figura 2C). Para obtener 10-12 ratones por grupo (inoculación de G. vaginalis vs. PBS), ~ 30 ratones deben estar infectados inicialmente con UPEC. Además, es probable que se requieran múltiples experimentos para lograr las réplicas biológicas necesarias para detectar la significación estadística. Cuando las exposiciones se administraron a 1 semana de diferencia, la emergencia de UPEC ocurrió en el 14% de los ratones expuestos a PBS (Figura 3B). Por lo tanto, la detección de un aumento significativo en upEC rUTI en ratones expuestos a G. vaginalis en relación con los controles de PBS (con una potencia de 0,8; alfa = 0,05 [un lado]) requiere probar un total acumulativo de al menos 40 ratones para cada grupo de exposición. Una consideración adicional es que estos experimentos son costosos y requieren mucha mano de obra. Los ratones deben ser monitoreados semanalmente para el aclaramiento de UPEC y el curso de tiempo experimental es de 4-5 semanas, dependiendo de si G. vaginalis se administra dos veces en un período de tiempo de 12 h o dos veces a 1 semana de distancia. SEM requiere mucha mano de obra y puede ser costoso, dependiendo de la disponibilidad del microscopio y los cargos por servicio. Preparar toda la vejiga para SEM proporciona abundante material para el análisis, pero el inconveniente es que analizar cada vejiga puede llevar mucho tiempo. Por lo tanto, es probable que solo un número limitado de vejigas pueda ser analizado por SEM en comparación con el mayor número de animales utilizados para los títulos de orina y tejido. Además, la obtención de imágenes de alta calidad de las superficies curvas de las "copas" de la vejiga requiere habilidad debido a las sombras que pueden impedir la visibilidad. Aunque el SEM de la vejiga es una herramienta útil para visualizar la exfoliación urotelial, este método es en gran medida cualitativo. Debido a que la muestra se fija en forma redonda, y debido al uso de glutaraldehído en el fijador, no es posible detectar bacterias que expresan fluorescentemente a través de microscopía de luz. La inmunotinción y los colorantes químicos son incompatibles con este proceso debido al uso de glutaraldehído que entrecruzará la mayoría de los antígenos y el osmio y que enmascarará los sitios de antígenos y oscurecerá el tejido. Dicho esto, la técnica SEM es útil para parámetros que pueden evaluarse cuantitativamente sin el uso de sondas adicionales, como el tamaño celular48,49.
Este modelo ofrece varias ventajas más allá de los métodos descritos anteriormente. Permite el examen de los mecanismos de UPEC rUTI causados por la emergencia de reservorios de la vejiga, en lugar de la reintroducción en la vejiga desde una fuente externa. Otros modelos de ITU debido a la aparición de reservorios vesicales utilizan agentes químicos (sulfato de protamina o quitosano) para causar exfoliación urotelial17,18, que no sería desencadenante de RUTI en mujeres. G. vaginalis es una bacteria urogenital prevalente que se ha detectado en la orina recogida directamente de la vejiga mediante cateterismo o aspiración suprapúbica en algunas mujeres23,26. Este hecho, junto con la asociación conocida entre la VB (en la que G. vaginalis crece demasiado en la vagina) y la ITU, sugiere que G. vaginalis es un desencadenante clínicamente plausible de la ITR. Finalmente, el método de fijación de la vejiga in situ preserva la ultraestructura de la vejiga y limita el daño, asegurando que las capas de la vejiga no se separen entre sí. Los métodos anteriores para visualizar el urotelio tradicionalmente hacen que el usuario recolecte asépticamente, biseque, estire y fije la vejiga en una bandeja de disección antes de sumergir la vejiga estirada en el fijador48. Este método da como resultado una muestra muy plana, pero no garantiza un estiramiento uniforme o natural del tejido y puede dar como resultado áreas que están demasiado y por debajo del estiramiento (lo que resulta en tejido altamente arrugado) y puede causar la separación de la capa de la vejiga. Además, estas manipulaciones físicas de la vejiga para estirar y fijar el tejido pueden causar daño, incluida la exfoliación urotelial. Otro método es sumergir las vejigas intactas en fijador antes de incrustarlas en parafina y adquirir secciones delgadas con un microtomo. Las secciones delgadas son invaluables para los experimentos de inmunohistoquímica para examinar la localización de bacterias y proteínas del huésped, pero una sección delgada no permite la visualización de la superficie urotelial. Este método SEM permite examinar la superficie de toda la vejiga a la vez.
Como se describe, las aplicaciones futuras de este modelo incluyen probar otras cepas de UPEC para determinar si forman reservorios intracelulares y probar otras cepas de G. vaginalis para evaluar si provocan la exfoliación y la aparición de UPEC para causar rUTI. También se pueden probar otras cepas de ratón más allá de los ratones C57BL / 6, aunque no se recomiendan ratones con una alta propensión a desarrollar cistitis crónica (como los ratones en el fondo C3H), ya que sería necesario seleccionar demasiados ratones del experimento. Una ventaja adicional de los ratones C57BL / 6 es que muchas cepas genéticas knockout están disponibles comercialmente. Tales cepas brindan una oportunidad para interrogar los factores del huésped involucrados en la formación y / o emergencia del reservorio.

Las infecciones del tracto urinario (ITU) imponen una carga sanitaria significativa en todo el mundo, afectando la calidad de vida de millones de personas cada año, especialmente las mujeres1. La Escherichia coli uropatógena (UPEC) es la causa más frecuente de ITU1. Muchos pacientes (aproximadamente 20-30%) que desarrollan ITU experimentarán una ITU recurrente (ITU) dentro de los 6 meses a pesar de la eliminación mediada por antibióticos de la infección inicial2. Desafortunadamente, hasta el 5% de las mujeres premenopáusicas sufren de 3 o más rUTI cada año 3,4. Los episodios secuenciales de ITU pueden ser causados por la persistencia de la misma cepa UPEC del caso índice 5,6,7,8. Los datos de muestras humanas y modelos de ratón sugieren que la ITU de la misma cepa podría ser causada por UPEC que reside dentro de reservorios inactivos en la vejiga. En humanos, se detectaron UPEC en células epiteliales y biopsias vesicales de pacientes con ITU 9,10,11,12,13. Los estudios en ratones C57BL/6 han demostrado que algunas cepas de UPEC pueden establecer reservorios intracelulares quiescentes en la vejiga, detectados por microscopía de fluorescencia y por homogeneización y cultivo de tejido vesical, que se mantienen durante meses después de la resolución de la bacteriuria 14,15,16. El tratamiento de la vejiga con agentes que inducen la exfoliación del epitelio vesical (urotelio), por ejemplo, sulfato de protamina17 o quitosano18, desencadenan la aparición de UPEC de los reservorios para causar ITU. Estos datos sugieren que en las mujeres que albergan reservorios de UPEC de la vejiga de una infección previa, las exposiciones de la vejiga que conducen a la exfoliación urotelial pueden desencadenar la ITU.
Cada vez hay más pruebas de que la microbiota vaginal contribuye a la infección del tracto urinario19,20. Gardnerella vaginalis es un miembro frecuente de la microbiota vaginal y urinaria 21,22,23,24,25,26,27,28,29. En la vagina, la presencia de altos niveles de G. vaginalis se asocia con una disbiosis microbiana conocida como vaginosis bacteriana (VB), que afecta a ~ 30% de las mujeres 30,31,32. Las mujeres con VB tienen un mayor riesgo de experimentar ITU en comparación con las mujeres con una comunidad vaginal dominada por Lactobacillus 33,34,35,36,37. En modelos de ratón, G. vaginalis causa exfoliación epitelial tanto en la vagina38 como en la vejiga39. En ratones C57BL/6 que albergan reservorios de vejiga DE UPEC, dos exposiciones secuenciales de la vejiga a G. vaginalis, pero no a PBS, resultan en el resurgimiento de UPEC de reservorios para causar ITU de UPEC. La aparición se evidencia por la aparición de títulos de UPEC en orina de ratones que habían resuelto previamente la bacteriuria de UPEC y una posterior disminución de los títulos homogeneizados de vejiga de UPEC en sacrificio en comparación con los animales de control expuestos a PBS39. Curiosamente, no hay una colonización duradera por G. vaginalis en la vejiga. En la gran mayoría de los casos, dos exposiciones cortas, cada una con menos de 12 (h) de G. vaginalis viable en la orina, son suficientes para provocar la exfoliación urotelial y promover la ITU.
Este protocolo describe un modelo de ratón de rUTI causada por UPEC que reside en reservorios de vejiga intracelular, utilizando la inoculación vesical de G. vaginalis para desencadenar la recurrencia. El avance logrado por este modelo es que G. vaginalis es un desencadenante biológico clínicamente relevante de rUTI en comparación con los agentes químicos utilizados anteriormente. Además, la supervivencia relativamente corta de G. vaginalis en el tracto urinario del ratón permite examinar el impacto de las exposiciones microbianas transitorias en el urotelio, como podría ocurrir después de la actividad sexual. Además de delinear el modelo rUTI, este protocolo también describe métodos para la citología de orina y la fijación de la vejiga in situ y la obtención de imágenes del urotelio mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).
Este protocolo de UPEC UTI recurrente inducida por G. vaginalis utiliza la cepa UPEC UTI89 que lleva un cassette de resistencia a la kanamicina (UTI89kanR)40. No todas las cepas de UPEC probadas fueron capaces de formar comunidades bacterianas intracelulares durante la etapa de infección aguda en ratones41 y aún no se sabe si todas las cepas de UPEC tienen la capacidad de formar reservorios intracelulares latentes. La formación del reservorio debe confirmarse antes del uso de otras cepas UPEC en el modelo. Este protocolo utiliza un aislado espontáneo de G. vaginalis resistente a la estreptomicina, JCP8151BSmR38. La inducción de rUTI por JCP8151BSmR requiere dos inoculaciones secuenciales de G. vaginalis , administradas con 12 h o 7 días (d) de diferencia39. Queda por determinar si otras cepas de G. vaginalis inducen o no la exfoliación y/o upec rUTI con este modelo. Es esencial usar cepas de UPEC y G. vaginalis con resistencia a los antibióticos conocida (como kanamicina o espectinomicina para UPEC y estreptomicina para G. vaginalis) porque se pueden agregar antibióticos a las placas de agar para prevenir el crecimiento de la microbiota endógena del ratón que de otro modo podría interferir con la enumeración de unidades formadoras de colonias (UFC) para monitorear la infección. Esto es especialmente importante para el cultivo de muestras de orina, porque la orina de ratón con frecuencia contiene otras bacterias que pueden crecer en exceso en las placas de cultivo sin antibióticos. El origen de estas bacterias endógenas en la orina de ratón es desconocido, pero probablemente refleja bacterias periuretrales y urogenitales recogidas durante la recolección de orina.
G. vaginalis es una bacteria anaeróbica facultativa y, por lo tanto, este protocolo describe el crecimiento de G. vaginalis JCP8151BSmR en una cámara anaeróbica. Si no se dispone de una cámara anaeróbica, se pueden utilizar otros métodos para mantener las condiciones de crecimiento anaeróbico (como una bolsa GasPak en un recipiente hermético). Alternativamente, algunas cepas de G. vaginalis (incluyendo JCP8151BSmR) crecerán en una incubadora estándar de cultivo de tejidos (5% co2). Así como el uso de cepas de G. vaginalis distintas de JCP8151BSmR requiere pruebas para garantizar que las bacterias se comporten de manera similar en este modelo, las condiciones de crecimiento cambiantes requieren la determinación empírica de duraciones ideales para el cultivo (en placas y en líquido) y la densidad óptica (OD) 600 equivalentes para lograr las concentraciones de inóculo viables deseadas. Además, no se sabe si las condiciones de crecimiento influyen en la patobiología de G. vaginalis.
Finalmente, al considerar si utilizar este modelo, los investigadores deben ser conscientes de que puede requerir un mayor número de animales por grupo que los modelos típicos de ratones UTI. Esto se debe en parte a que la inducción de rUTI requiere que los ratones resuelvan la bacteriuria UPEC causada por la infección inicial de la vejiga. Por lo tanto, cualquier ratón que no logre eliminar la bacteriuria (un fenotipo generalmente indicativo de infección renal en curso) no está incluido en la fase de ITU del protocolo. El número de ratones necesarios para impulsar estos estudios también está influenciado por la tasa de aparición "espontánea" de UPEC en la orina (12-14% en promedio). Finalmente, las diferentes cepas de ratón tienen diferentes propensiones a desarrollar bacteriuria crónica frente a la formación de reservorios intracelulares42,43. Si se utilizan cepas de ratón distintas de C57BL/6 en este modelo, debe confirmarse que los animales desarrollan reservorios intracelulares UPEC inactivos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 1/2&#34; straight forcep hemostat</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>487377</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACE 600 Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aluminum SEM stub</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16111</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12340</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive carbon adhesive tab&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive silver paint</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16034</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 300 Critical Point Drier</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofunnel metal clip</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964B</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15050</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16320</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hema 3 staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23123869</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro&#160;</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iridium</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91120</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isofluorane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mouse anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815024</td>
			<td>add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0445174</td>
			<td>UPEC growth plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td>UPEC growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin FE-SEM</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>scanning electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IQ-7000</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Vanox AHBT3 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19170</td>
			<td>SEM sample processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone #3&#160;</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>DF-122-17-4</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE coated double edge razor blade</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td>cutting bladders for SEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A78300002</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon cytofunnel filter</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M965FWDV</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Double cytofunnel</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M964-1D</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon double cytoslides (coated)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5991055</td>
			<td>cytospun urinalysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12310</td>
			<td>in situ bladder fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer</td>
			<td>BioChrom</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>measuring bacterial OD600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11860038</td>
			<td>add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tuberculin slip tip syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>for catheters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0127-17-9</td>
			<td>for NYCIII G. vaginalis growth media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent escherichia coli urinary tract infection triggered by gardnerella vaginalis bladder exposure in mice

Las infecciones recurrentes del tracto urinario (ITR) causadas por Escherichia coli uropatógena (UPEC) son comunes y costosas. Artículos anteriores que describen modelos de ITU en ratones machos y hembras han ilustrado los procedimientos para la inoculación bacteriana y la enumeración en orina y tejidos. Durante una infección inicial de la vejiga en ratones C57BL/6, la UPEC establece reservorios latentes dentro de las células epiteliales de la vejiga que persisten después de la eliminación de la bacteriuria de la UPEC. Este modelo se basa en estos estudios para examinar la ITU causada por la aparición de UPEC desde el interior de los reservorios de vejiga latente. La bacteria urogenital Gardnerella vaginalis se utiliza como desencadenante de la ITU en este modelo porque está frecuentemente presente en los tractos urogenitales de las mujeres, especialmente en el contexto de la disbiosis vaginal que se ha asociado con la ITU. Además, también se describe un método para la fijación de la vejiga in situ seguido del análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) del tejido de la vejiga, con posible aplicación a otros estudios que involucren la vejiga.

Después de la inoculación, los títulos de UPEC son detectables en la orina (Figura 2B). La falta de placas de muestras de orina en medios selectivos que contengan kanamicina probablemente resultará en un crecimiento excesivo de la microbiota endógena del ratón que contamina la orina. El nivel de bacteriuria UPEC probablemente será alto el día 1 y puede aumentar durante la primera semana antes de disminuir en puntos de tiempo posteriores (Figura 2C). Aproximadamente el 65-80% de los ratones no tendrán UPEC detectable en la orina a 28 dpi (Figura 2C, círculo verde). Estos ratones se pueden utilizar en los pasos posteriores del modelo. Los ratones que permanecen bacteriúricos (Figura 2C, elipse roja) deben ser eliminados del experimento.
Dos exposiciones secuenciales a G. vaginalis administradas a 12 h (Figura 3A) o 1 semana de distancia (Figura 3B) dan como resultado la aparición de UPEC a partir de reservorios intracelulares para causar bacteriuria recurrente. Tanto el nivel de bacteriuria UPEC (prueba de Mann-Whitney) como la fracción de ratones que muestran UPEC rUTI (prueba exacta de Fisher) son significativamente más altos en ratones expuestos a G. vaginalis en comparación con el grupo de control de PBS. El análisis de citología de orina detecta PMN en orina de ratones expuestos a G. vaginalis que mostraron emergencia de UPEC (Figura 3C). En el modelo con dos exposiciones dadas a 1 semana de diferencia, los títulos de UPEC en el tejido de la vejiga son más bajos en ratones expuestos a G. vaginalis en comparación con PBS (Figura 3D), presumiblemente debido a la aparición de UPEC a partir de reservorios y el aclaramiento posterior.
La visualización del tejido vesical fijo in situ por SEM revela grandes células uroteliales paraguas superficiales que recubren la superficie de la vejiga en ratones de control expuestos solo a PBS (Figura 4A). La exfoliación urotelial se evidencia por una pérdida de células paraguas superficiales, revelando células epiteliales de transición subyacentes más pequeñas en ratones expuestos a G. vaginalis (Figura 4B). Temprano después de la inoculación de UPEC durante el establecimiento de reservorios intracelulares, los UPEC son visibles en el urotelio y el filamento de las células exfoliantes (Figura 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Figura 2. Monitoreo de títulos de UPEC en orina durante la Fase 1 (formación de reservorios). (A) Esquema de recubrimiento de unidades formadoras de colonias (UFC). (B) Imagen representativa de los títulos de UPEC en orina en LB+kanamicina. Los círculos negros indican manchas de muestra de orina que deben contarse para calcular la UFC/ml. (C) Curso temporal de la bacteriuria UPEC en ratones C57BL/6. Cada línea representa un ratón individual, trazando los títulos de orina UPEC a lo largo del tiempo. La línea punteada indica el límite de detección (1000 UFC/ml). La elipse roja indica cuatro ratones (de 20) que no lograron resolver la bacteriuria UPEC y, por lo tanto, no se utilizarían para el modelo de ITU inducida por G. vaginalis. Por el contrario, el círculo verde indica ratones que resolvieron la bacteriuria UPEC y procedieron a las fases posteriores. D) Tabla de datos utilizados para generar el gráfico en el panel C. Ufc amarilla detectable; verde, sin UFC. (E) Aleatorización de ratones en grupos de exposición basados en el punto de tiempo en el que la UFC UPEC ya no se detectó en la orina ("Día resuelto"). Los números del mouse en la columna izquierda del panel D son los mismos números del mouse que se indican en el panel E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Figura 3. G. vaginalis desencadena UPEC rUTI. Títulos de UPEC en la orina después de dos exposiciones secuenciales del tracto urinario a PBS (círculos) o G. vaginalis (Gvag; cuadrados) administradas con 12 h (A) o 1 semana (B) de diferencia. Cada símbolo representa un ratón individual. Se trazan los UPEC de UFC/ml más altos detectados en cada ratón entre 1-3 d después de la segunda exposición. Los ratones sin bacteriuria detectable se trazan en el límite de detección (línea punteada). (C) Análisis de citología de orina que muestra células UPEC (puntas de flecha) y polimorfonucleares (PMN) (flechas). Barra de escala = 20 μm. (D) Títulos de UPEC en tejidos de la vejiga recogidos 3 d después de dos exposiciones secuenciales del tracto urinario administradas a 1 semana de diferencia. Cada símbolo representa un ratón diferente y los ceros se trazan en el límite de detección (línea punteada). En A, B y D, las cajas están en el primer y tercer cuartil con la mediana marcada y los bigotes de min a max. Mann-Whitney U tests * P < 0.05; ** P < 0,01; P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Figura 4. Análisis SEM de vejigas fijadas in situ. Las vejigas se recogieron de ratones 3 h después de dos exposiciones (12 h de diferencia) a PBS (A) o G. vaginalis (C). Las líneas punteadas ilustran una sola célula epitelial urinaria, que es más pequeña en las vejigas expuestas a G. vaginalis porque las grandes células superficiales se han exfoliado revelando el epitelio de transición subyacente. (B) Vejiga recogida 6 h después de la inoculación inicial con UPEC, durante la Fase 1 del modelo, mostrando exfoliación urotelial y UPEC extracelular. (D) Ejemplo de gotas de grasa insolubles presentes en la superficie de la vejiga. Las barras de escala son de 20 μm en las imágenes principales y 2 μm en el recuadro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

recurrent-escherichia-coli-urinary-tract-infection-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

5.7K vistas.  Washington University School of Medicine in Saint Louis. Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

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Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on Luria-Bertani (LB) agar at 37&deg;C in ambient air. UPEC strains grow as yellowish-white translucent colonies on LB agar. Following confirmation of appropriate colony morphology, single colonies are then picked to be cultured in broth. LB broth can be used for most uropathogenic bacterial strains. Two serial, overnight LB broth cultures can be employed to enhance expression of type I pili, a well-defined virulence factor for uropathogenic bacteria. Broth cultures are diluted to the desired concentration in phosphate buffered saline (PBS). Eight to 12 week old female mice are placed under isoflurane anesthesia and transurethrally inoculated with bacteria using polyethylene tubing-covered 30 gauge syringes. Typical inocula, which must be empirically determined for each bacterial/mouse strain combination, are 106 to 108 cfu per mouse in 10 to 50 microliters of PBS. After the desired infection period (one day to several weeks), urine samples and the bladder and both kidneys are harvested. Each organ is minced, placed in PBS, and homogenized in a Blue Bullet homogenizer. Urine and tissue homogenates are serially diluted in PBS and cultured on appropriate agar. The following day, colony forming units are counted.

This video will demonstrate methods to transurethrally induce mouse urinary tract infections and quantify the extent of resulting infections.

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Investigación

Inmunología e Infección

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Modelo no invasiva de neuropatogénico<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La infección en Neonatología Rata

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.