Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation Grant MCB-0092919 und den Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (an RJP) sowie durch den National Institutes of Health Grant GM-38740 und das Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (an JLW) unterstützt.
Das minx pre-mRNA-Substrat, das in den Spleißassays verwendet wurde, war ein freundliches Geschenk von Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

1. Hinweise zu den allgemeinen Verfahren
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Chemikalien (Pufferkomponenten, Enzyme usw.) frei von Ribonuklease (RNase) gehalten werden. Sequester alle kommerziell gekauften Reagenzflaschen aus dem allgemeinen Laborgebrauch. Tragen Sie Handschuhe für alle Schritte des experimentellen Verfahrens. Verwenden Sie nur Gebackene Gläser und Utensilien (siehe Schritt 1.2 unten) und vorbehandelte Lösungen (siehe Schritt 1.3 unten).</li>
	<li>Alle Gläser (Becher, Kolben, Flaschen, Pipetten usw.) für mindestens 4 h bei 177 °C backen. Wickeln Sie andere Utensilien (Spatel, Rührstangen usw.) vor dem Backen unter den gleichen Bedingungen in Alufolie.</li>
	<li>Eine 0,1%ige (vol/vol) Lösung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) herstellen. Mit einem magnetischen Rührstab diese Lösung über Nacht umrühren und dann autoklavieren. Verwenden Sie dieses DEPC-behandelte H2O, um alle Lösungen herzustellen, die Tris enthalten; Filtern Sie dann mit einem Flaschendevakuumfilter. Verwenden Sie normales ddH2O, um alle anderen Lösungen (ohne Tris) vorzubereiten; dann mit DEPC (0,1%, vol/vol) und Autoklav behandeln. ANMERKUNG: Die in den folgenden experimentellen Verfahren verwendeten Puffer sind in Tabelle 1 alphabetisch aufgeführt.</li>
</ol><table><tbody>
<tr>
<td>Name des Puffers</td>
			<td>Zusammensetzung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Boratpuffer</td>
			<td>0,2 M Natriumborat, pH 9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Puffer C</td>
			<td>20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) Glycerin, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM Dithiothreitol (DTT)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Puffer D</td>
			<td>10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) Glycerin, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>60%D</td>
			<td>60% Puffer D und 40% H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethanolamin</td>
			<td>0,2 M Ethanolamin, pH 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES-Bindungspuffer</td>
			<td>20 mM HEPES, pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES Waschpuffer</td>
			<td>20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA-Ladepuffer</td>
			<td>90% Formamid, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) Bromphenolblau</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS-PAGE-Puffer</td>
			<td>25 mM Tris, 169 mM Glycin, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS-Probenpuffer</td>
			<td>62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 0,1% (w/v) Bromphenolblau</td>
		</tr>
<tr>
<td>FSME-Puffer für RNA-Gele</td>
			<td>89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA, pH 8,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>TE-Puffer</td>
			<td>10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Übertragungspuffer</td>
			<td>25 mM Tris, 1,92 M Glycin, 20% Methanol, pH 8,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-TBS-Puffer</td>
			<td>10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>TX Waschpuffer</td>
			<td>0,05% Triton X-100 (TX) in 60%D</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Name und Zusammensetzung der Puffer

2. Herstellung von NE erschöpft von U1 snRNP (U1 ΔNE)
<ol><li>Herstellung von Anti-U1-Kügelchen für die Immunadsorption<ol>
<li>50 mg Protein A-Sepharose CL-4B Perlen im Überschuss dePC-behandeltes H2O vorschwillieren, um etwa 200 μL geschwollene Perlen zu erzeugen und dann in HEPES-Waschpuffer zu waschen.</li>
		<li>Für diese Wäsche und alle nachfolgenden Wäschen die Kügelchen durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwenkbaren Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s) pelletieren und die ungebundene Wäsche mit einem Mikropipettor entnehmen und entsorgen.</li>
		<li>Mischen Sie 150 μL gewaschene Perlen mit 150 μL humanem Autoimmunserum, das spezifisch für U1 snRNP ist (Volumen des Antikörpers zum Volumen der Perlen im Verhältnis 1: 1).</li>
		<li>Auf der Grundlage des Gesamtvolumens von (~300 μL aus Schritt 2.1.3 oben) wird das Gemisch auf 20 mM HEPES, pH 7,9, entsprechend den Bedingungen des HEPES-Bindungspuffers eingestellt; Inkubieren Sie diese Mischung mit kontinuierlichem Schaukeln bei Raumtemperatur für 60 min.</li>
		<li>Waschen Sie die mit Antikörpern gebundenen Kügelchen mit 1 ml Boratpuffer (0,2 M Natriumborat, pH 9) und resuspendieren Sie in 1 ml desselben Boratpuffers.</li>
		<li>Um den an das Protein A-Sepharose gebundenen Antikörper kovalent zu koppeln, Dimethylpimelimidat in eine Endkonzentration von 20 mM zu geben und bei Raumtemperatur mit Schaukeln für 60 min zu inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen mit 1 ml Boratpuffer.</li>
		<li>Um ein nicht umgesetztes Vernetzungsreagenz zu blockieren, fügen Sie 1 ml 0,2 M Ethanolamin (pH 8) hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit Schaukeln für 60 min.</li>
		<li>Waschen Sie die Antikörper-gekoppelten Kügelchen, im Folgenden als Anti-U1-Kügelchen bezeichnet, zweimal mit 0,5 ml TX-Waschpuffer (0,05% Triton X-100 in 60% D).</li>
	</ol></li>
	<li>Depletion von U1 snRNP aus NE (siehe Abbildung 1A) HINWEIS: Das Verfahren zur Herstellung von NE aus HeLa-Zellen wurde ursprünglich von Dignam et al.20 entwickelt. Wir haben die Materialien und detaillierten Methoden zur Herstellung von NE für Spleißassays19 beschrieben (siehe Schritte 2.1 und 3.1 dieser Referenz). NE, wie ursprünglich vorbereitet, befindet sich in Puffer C und wird im Folgenden als NE(C) bezeichnet. NE(C), das gegen Puffer D dialysiert und mit puffer D ausgeglichen ist, wird als NE(D) bezeichnet.<ol>
<li>Inkubieren Sie 200 μL NE(C) mit 100 μL Anti-U1-Perlen aus Schritt 2.1.9 oben.</li>
		<li>Fügen Sie 5 μL RNasin zu der Mischung hinzu.</li>
		<li>Drehen Sie das Mikroröhrchen 1 h lang Kopf über Schwanz bei 4 °C.</li>
		<li>Pelletieren Sie die Mischung durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s) und sammeln Sie das ungebundene Material (U1ΔNE) mit einer Hamilton-Spritze.</li>
		<li>Dialysieren Sie das gesamte Volumen von U1ΔNE, zusammen mit einem separaten 50 μL Aliquot des ursprünglichen, nicht vollständigen NE(C), in separaten Kompartimenten eines Mikrodialysators unter Rühren für 75 min gegen 60% D unter Verwendung einer Dialysemembran mit 8 K Molekulargewichtsgrenzung.</li>
		<li>Diese Präparate (U1ΔNE und NE in 60% D) werden unmittelbar nach der Dialyse in 20 μL Aliquots aufgeteilt; anschließend in einem Trockeneis/Ethanol-Bad einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des RNA- und Proteingehalts von U1ΔNE und an Anti-U1-Kügelchen gebundenem Material<ol>
<li>Nach dem Entfernen des ungebundenen Materials (U1ΔNE) (Schritt 2.2.4) wird das an den Anti-U1-Kügelchen gebundene Material durch Zugabe von 0,5 ml TX-Waschpuffer gewaschen. Pelletieren Sie die Mischung durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s) und entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und entsorgen Sie ihn.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Waschschritte 2.3.1 zweimal.</li>
		<li>Entfernen Sie das an die Anti-U1-Kügelchen gebundene Material, indem Sie 100 μL 2x SDS-Probenpuffer zu 100 μL der Kügelchen hinzufügen und für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Pellet die Mischung durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s); Entfernen Sie den Überstand mit der Hamilton-Spritze und frieren Sie ihn in einem Trockeneis-/Ethanolbad ein. Bei -80 °C lagern.</li>
		<li>Vergleichen Sie das nicht depleted NE, das erschöpfte NE (U1ΔNE) und das an die Perlen gebundene Material (aus den Kügelchen entfernt durch SDS-Probenpuffer, wie in den Schritten 2.3.3 und 2.3.4 oben beschrieben). Befolgen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 für die RNA-Analyse oder die Schritte 2.3.9-2.3.10 für die Proteinanalyse.</li>
		<li>Extrahieren Sie für jede Probe die RNA mit 200 μL Phenol-Chloroform (50:50, v/v); anschließend erneut mit 180 μL Chloroform-Isoamylalkohol (25:1, v/v) extrahieren. Nach der Extraktion 300 μL kaltes 200-beständiges Ethanol zugeben, zum Mischen invertieren und die ausgefällte RNA über Nacht bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Ethanol-ausgefällte RNA (12.000 x g für 10 min bei 4 °C). Waschen Sie die Pellets mit 150 μL kaltem 70% Ethanol. Zentrifugiere erneut (12.000 x g) bei 4 °C für 15 min. Entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und trocknen Sie die Pellets in einem Geschwindigkeitssauger für 10-15 min ohne Hitze.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das getrocknete RNA-Pellet in 10 μL RNA-Ladepuffer, wirbeln Sie vorsichtig, erhitzen Sie es auf 75-85 ° C für 90 s und inkubieren Sie es dann für 2 min auf Eis. Trennen Sie die snRNAs durch Gelelektrophorese (2 h bei 16 mA) durch 13% Polyacrylamid - 8,3 M Harnstoffgele und färben Sie sie dann entweder mit Ethidiumbromid an oder unterliegen Sie einem Northern Blotting10,16.</li>
		<li>Laden Sie die Proteinproben in SDS-Probenpuffer aus Schritt 2.3.5 auf 12,5% Polyacrylamidgele und Elektrophorrese bei 200 V für ca. 45-50 min in SDS-PAGE-Puffer (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese).</li>
		<li>Übertragen Sie die getrennten Proteine auf die Nitrocellulosemembran bei 400 mA für 2 h im Transferpuffer. Blockieren Sie nach dem Transfer die Membran durch Inkubation über Nacht in T-TBS, das 10% fettfreie Trockenmilch enthält. Dann immunoblot die Membran, um spezifische Proteine aufzudecken8,21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Immunpräzipitation von 10S-Fraktionen von Glyceringradienten durch Anti-Gal3
<ol><li>Herstellung von Anti-Gal3-Perlen zur Immunadsorption HINWEIS: Die Ableitung und Charakterisierung von kaninchenpolyklonalen Antiseren gegen Gal3 für Kaninchen #2421 und für Kaninchen #4910 wurden zuvor beschrieben.<ol>
<li>Verwenden Sie Präimmunserum von Kaninchen # 49 als Kontrolle.</li>
		<li>Für die Herstellung von Anti-Gal3-Perlen befolgen Sie das zuvor beschriebene Verfahren zur Herstellung von Anti-U1-Perlen (Schritt 2.1), mit der Ausnahme, dass entsprechend Schritt 2.1.3 das Verhältnis von Antiserum (z. B. Anti-Gal3, Nr. 49) zu Perlen 3: 1 beträgt.</li>
		<li>Kurz vor Gebrauch die Antikörper-gekoppelten Kügelchen, im Folgenden als Anti-Gal3-Kügelchen bezeichnet, zweimal mit 0,5 ml TX-Waschpuffer waschen. Entfernen Sie den Überstand, zuerst mit einem Mikropipettor, um den größten Teil der Flüssigkeit herauszuholen, und dann mit einer Hamilton-Spritze, um die Flüssigkeit aus den Perlen zu bekommen; abwerfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunpräzipitation von Glyceringradientenfraktionen durch Anti-Gal3 (siehe Abbildung 1B)<ol>
<li>Fraktionieren Sie NE(D) über einen 12%-32%igen Glyceringradienten10. Kombinieren und mischen Sie die Glyceringradientenfraktionen 3, 4 und 5 (nummeriert von der Spitze des Gradienten), die sich in der Nähe des 10S-Bereichs des Gradienten befinden.</li>
		<li>Bereiten Sie zwei Proben mit jeweils 150 μL Aliquot kombinierter Gradientenfraktionen 3-5 (Schritt 3.2.1) vor und geben Sie sie in 50 μL Anti-Gal3-Kügelchen.</li>
		<li>Bereiten Sie parallel zwei Proben mit jeweils 150 μL Fraktion 1 vor (enthält Gal3 nicht im Komplex mit U1 snRNP10; Schritt 3.2.1) und legen Sie sie in 50 μL Anti-Gal3-Kügelchen.</li>
		<li>Als Kontrolle geben Sie 150 μL 60% D in ein anderes Mikroröhrchen mit 50 μL Anti-Gal3-Perlen.</li>
		<li>Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf das Rohr klopfen, und drehen Sie dann das Mikroröhrchen bei 4 ° C für 1 h.</li>
		<li>Pelletieren Sie die Mischung durch schonende Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s).</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand (ungebundenes Material) mit einer Hamilton-Spritze. Waschen Sie die Perlen nicht und verwenden Sie sie sofort für die Zugabe der Spleißreaktionen (Abschnitt 4.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse des RNA- und Proteingehalts im ungebundenen und gebundenen Material aus der Anti-Gal3-Fällung von 10S-Gradientenfraktionen<ol>
<li>Zur Analyse der Komponenten des gebundenen und ungebundenen Materials aus der Anti-Gal3-Ausfällung der 10S-Gradientenfraktionen wird das ungebundene Material (Überstand nach Schritt 3.2.6) aufgefangen, in ein frisches Mikroröhrchen überführt und bei -20 °C eingefroren.</li>
		<li>Die ausgefällten Kügelchen aus Schritt 3.2.6 (die an Anti-Gal3 gebundenes Material enthalten) werden durch Zugabe von 0,5 ml TX-Waschpuffer gewaschen.</li>
		<li>Pellet die Mischung durch schonende Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s); Entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und verwerfen Sie ihn. Wiederholen Sie die Waschschritte noch zweimal.</li>
		<li>50 μL 2X SDS Probenpuffer zu den gewaschenen und pelletierten Anti-Gal3-Kügelchen geben.</li>
		<li>Mischen Sie die Perlen vorsichtig und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Pelletieren Sie die Mischung durch schonende Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s), sammeln Sie den Überstand durch Hamilton Spritze und lagern Sie ihn in einem frischen Mikroröhrchen bei -20 °C.</li>
		<li>Vergleichen Sie das ungebundene Material (Abschnitt 3.3.1) und das gebundene Material (Schritt 3.3.6) der Anti-Gal3-Fällung in Bezug auf RNA- und Proteinkomponenten unter Verwendung der in Schritt 2.3.6 beschriebenen Verfahren. bis 2.3.10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Montage der Spleißreaktion und Analyse der Produkte
<ol><li>Vorbereitung des Spleißsubstrats HINWEIS: Das prä-mRNA-Substrat, minX genannt, enthält zwei Exonsequenzen und eine Intronsequenz aus dem Adenovirus22. Die MINX-DNA-Sequenz im Plasmid steht unter der Kontrolle von T3-, T7- oder SP6-RNA-Polymerase-Promotoren. Die Materialien und detaillierten Methoden zur Linearisierung der MINX-Plasmid-DNA mit BamHI-Restriktionsendonuklease, zur Transkription durch SP6-RNA-Polymerase in Gegenwart von α-32P[GTP] und zur Aufreinigung von 32P-markiertem MINX für Spleißassays sind zuvor beschrieben19 (siehe Schritte 2.2 und 3.2 dieser Referenz).<ol>
<li>Lagern Sie das radioaktiv markierte MINX als Ethanolausscheidung bei -20 °C; Verwenden Sie das markierte Spleißsubstrat innerhalb von 4-6 Wochen nach der Transkription.</li>
		<li>Kurz vor Gebrauch zentrifugieren Sie das ethanolgeleitete 32P-markierte MINX bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C; Entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und verwerfen Sie ihn.</li>
		<li>150 μL 70% Ethanol zugeben und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet in Geschwindigkeit vac ohne Hitze für 15 min.</li>
		<li>Rehydrieren Sie das Pellet in 50 μL DEPC-Wasser. Spot 2 μL auf jedem der beiden GF/C-Filter; Tauchen Sie die Filter für 10 min in kalte 5% Trichloressigsäure (TCA). Spülen Sie mit kaltem 5% TCA, gefolgt von 180-beständigem Ethanol auf einer Vakuumflasche. Trocknen Sie die Filter an der Luft und unterziehen Sie die Szintillationszählung in 4 mL Safety-Solve.</li>
		<li>Verdünnen Sie 32P-markiertes MINX in 60% D auf 104 cpm/μL für den Spleißassay.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbau der Spleißreaktion (siehe Abbildung 1C)<ol>
<li>Auf Eis spleißende Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 24 μL (8 μL U1ΔNE (aus Schritt 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM Kreatinphosphat, 0,5 mM DTT, 20 Einheiten RNasin, 4 μL 32P-markiertes MINX-Spleißsubstrat (104 cpm/μL), 60% D) zusammensetzen und in jedes Röhrchen mit Perlen aus Abschnitt 3.2.7 geben. Fügen Sie einen identischen Satz von Spleißreaktionen in einem Gesamtvolumen von 24 μL, aber ohne U1ΔNE zusammen und fügen Sie jedem Kürmchen Perlen aus Schritt 3.2.7 hinzu.</li>
		<li>Vorbereiten einer Kontrollspleißreaktion in einem Gesamtvolumen von 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM Kreatinphosphat, 0,5 mM DTT, 20 Einheiten RNasin, 2 μL 32P-markiertes MINX-Spleißsubstrat (104 cpm/μL), 60% D).</li>
		<li>Mischen Sie die Rohre vorsichtig durch Klopfen und drehen Sie es bei 30 ° C für 90 min. Pelletieren Sie die Mischung durch schonende Zentrifugation bei 1.000 x g in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C für 10-15 s.</li>
		<li>Stoppen Sie die Reaktion und eluieren Sie die Proteine von den Kügelchen, indem Sie 24 μL 2x SDS-Probenpuffer zu den Röhrchen mit Perlen und 12 μL 2x SDS-Probenpuffer in das Kontrollröhrchen geben, das NE, aber keine Kügelchen enthält. Erhitzen Sie die Rohre bei 100 °C für 7 min.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Rohre vorsichtig bei 1.000 x g in einem schwenkbaren Schaufelrotor bei 4 °C für 10-15 s.</li>
		<li>Die Überstände (Elutionen) werden in frische Mikroröhrchen überführt: ca. 48 μL aus den Kügelchen und 24 μL aus dem NE-Steuerrohr.</li>
		<li>Proteinase K (20 mg/ml) hinzufügen, um die Proteine zu verdauen und zu lösen: Fügen Sie 5 μL zur 48 μL-Elution aus Perlen hinzu und fügen Sie 2,5 μL zur 24 μL NE-Kontrolle hinzu.</li>
		<li>Die Röhrchen bei 37°C für 40 min inkubieren.</li>
		<li>Vorsichtig zentrifugieren Sie die Rohre bei 1.000 x g in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C für 10 s.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Perlenelutionen mit 39,5 μL TE und 10 μL 3 M Natriumacetat. Verdünnen Sie die NE-Kontrolle mit 63,5 μL TE und 10 μL 3 M Natriumacetat.</li>
		<li>Extrahieren und analysieren Sie die RNA wie unten beschrieben (Abschnitt 4.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse der Produkte der Spleißreaktion<ol>
<li>Extrahieren Sie die RNAs in jeder Probe mit Phenol-Chloroform, gefolgt von Chloroform-Isoamylalkohol; die RNAs mit Ethanol ausfällen, zentrifugieren, die Pellets waschen, den Überstand entfernen und die Pellets nach dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 2.3.6 und 2.3.7 beschrieben trocknen.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das getrocknete RNA-Pellet in 10 μL RNA-Ladepuffer, wirbeln Sie vorsichtig, erhitzen Sie es auf 75-85 ° C für 90 s und inkubieren Sie es dann für 2 min auf Eis.</li>
		<li>20 mL einer Lösung, die 13% Polyacrylamid (Bisacrylamid:Acrylamid, 1,9:50 [gew./gew.]) enthält, in 8,3 M Harnstoff herstellen; gegossene Gele mit einer Länge von 15 cm mit dieser Lösung.</li>
		<li>Sobald das Gel gegossen ist, elektrophorisieren Sie es (ohne geladene Proben) bei 400 V für 20 minuten mit FSME als Laufpuffer. Nach diesem Schritt waschen Sie die Vertiefungen mit FSME-Laufpuffer.</li>
		<li>Laden Sie die RNA-Proben in RNA-Ladepuffer und Elektrophorrese mit FSME-Laufpuffer bei 400 V für 3,5 bis 4 h. Nach der Elektrophorese entfernen Sie den Harnstoff, indem Sie das Gel 10 Minuten lang in destilliertem Wasser eintauchen und drehen.</li>
		<li>Vakuumtrocknen Sie das Gel auf 3 M Filterpapier, zuerst für 2 h 15 min bei 80 °C und dann für 30 min ohne Hitze, um es langsam abzukühlen. Unterziehen Sie das getrocknete Gel einer Autoradiographie auf Film, um die Migrationspositionen der radioaktiven Bestandteile zu erkennen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spliceosome:+a+flexible,+reversible+macromolecular+machine.">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li><li>Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins:+role+in+RNA+splicing.">Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing.</a> Science. 231, 1534-1539 (1986).</li><li>Lerner, M., Steitz, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+spliceosomal+RNAs+by+antisera+to+galectin-1+and+galectin-3.">Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3.</a> Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP.">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li><li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li><li>Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+splicing+factors+are+released+from+endogenous+complexes+during+in+vitro+pre-mRNA+splicing.">Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).</li><li>Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+glycerol+gradient+isolation+of+yeast+spliceosomes+containing+transcribed+or+synthetic+U6+snRNA.">Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).</li><li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes.">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li><li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5'+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex.">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes.">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li><li>Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomic+analysis+of+the+human+spliceosome.">Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome.</a> Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).</li><li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism.">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li><li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing.">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-binding+protein+35.+I.+Properties+of+the+recombinant+polypeptide+and+the+individuality+of+the+domains.">Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).</li><li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li><li>Barondes, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectins:+a+family+of+animal+&#946;-galactoside-binding+proteins.">Galectins: a family of animal &#946;-galactoside-binding proteins.</a> Cell. 76, 597-598 (1994).</li><li>Laing, J. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carbohydrate+binding+protein+35+in+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex.</a> Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).</li><li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components.">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li><li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway.">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes &amp; Development. 5, 2534-2546 (1991).</li><li>Chiu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction.">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing.">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li><li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3.">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Dieser Bericht enthält die experimentellen Details, die einen Gal3 - U1 snRNP-Komplex dokumentieren, der auf Anti-Gal3-beschichteten Kügelchen gefangen ist, kann an prä-mRNA-Substrat binden und dieser ternäre Komplex kann die Spleißaktivität zu einem U1 snRNP-depletierten NE wiederherstellen. Gal3 ist ein Mitglied einer Familie von Proteinen, die ursprünglich auf der Grundlage seiner Galactose-spezifischen Kohlenhydratbindungsaktivität isoliert wurden23 . Frühe Immunfluoreszenz- und subze...

Die Produktion der meisten eukaryotischen Boten-RNAs (mRNAs) beinhaltet die Entfernung von Introns und die Ligatur von Exons in einem Kernprozess, der als Prä-mRNA-Spleißen bezeichnet wird1. Zwei Klassen von RNA-Protein-Komplexen (RNPs) lenken die Verarbeitung von Pre-Messenger-RNA in reife mRNA über spleißosomale Komplexe. Eine Klasse, entstehende Prä-Messenger-RNPs, wird co-transkriptionell durch die Bindung heterogener kerniger RNP-Proteine und anderer RNA-bindender Proteine, einschließlich einiger Mitglieder der SR-Familie, gebildet, was hnRNP-Komplexe ergibt2. Die zweite Klasse, Uracil-reiche kleine Kern-RNPs (U snRNPs mit U1, U2, U4, U5 und U6 snRNAs) ist mit U-spezifischen und Kernproteinen assoziiert3,4. Die U-snRNPs interagieren geordnet mit bestimmten Regionen von Pre-Messenger-RNPs in einem dynamischen Remodeling-Pfad, wenn Introns herausgeschnitten und Exons ligatiert werden, um reife mRNPs zu erzeugen5. Viele weitere Kernproteine sind an diesen Verarbeitungsereignissen beteiligt6.
Galectin-1 (Gal1) und Galectin-3 (Gal3) sind zwei Proteine, die erforderliche Faktoren im Spleißweg sind, wie Ausschöpfungs-Rekonstitutionsstudien zeigen7,8. Die Entfernung beider Galectine aus dem Spleißen kompetenter Kernextrakte (NE) schafft die Spleißosomenmontage und die Spleißaktivität frühzeitig ab. Die Zugabe von Galektin zu einem so doppelt erschöpften NE stellt beide Aktivitäten wieder her. Gal1 und Gal3 sind Komponenten aktiver Spleißosomen, wie durch spezifische Immunpräzipitation von pre-mRNA, spleißenden Zwischenprodukten und reifer mRNA durch Antiserum spezifisch für Gal1 oder Gal39 belegt wird. Wichtig ist, dass Gal3 mit endogener U-snRNA assoziiert ist, die Partikel im NORDOSTEN außerhalb des Spleißweges enthält, wie die Ausfällung von snRNPs durch Anti-Gal3-Antisera10 zeigt. Schließlich verändert das Stummschalten von Gal3 in HeLa-Zellen die Spleißmuster zahlreicher Gene11.
In NE, die vorinkubiert wurden, um vorgeformte Spleißosomen12 zu zerlegen, werden snRNPs in mehreren Komplexen gefunden, die in Glyceringradienten von 7S bis größer als 60S sedimentieren. Obwohl die Glyceringradientenfraktionierung eine gängige Technik zur Isolierung von spleißosomalen Komplexen und Komponenten ist (siehe z.B. Referenzen 13,14,15), haben wir diese Methode erweitert, indem wir spezifische Fraktionen mittels Antikörperimmunpräzipitationen charakterisieren. Eine snRNP-Sedimentation bei 10S enthält nur U1-snRNA zusammen mit Gal3. Die Immunpräzipitation der 10S-Fraktion mit Antiseren, die spezifisch für Gal3 oder U1 snRNP sind, ko-präzipitiert sowohl U1 als auch Gal3, was darauf hindeutet, dass einige der U1-snRNP-Monopartikel an Gal310 gebunden sind. Da U1 snRNP der erste Komplex ist, der in der spleißosomalen Montage an prä-mRNP bindet1,5, stellt dieser Schritt eine potenzielle Eintrittsstelle für Gal3 in den Spleißweg dar. Auf dieser Grundlage zeigten wir, dass 10S Gal3-U1 snRNP-Monopartikel, die an Anti-Gal3-haltige Kügelchen gebunden waren, die Spleißaktivität eines U1-snRNP-erschöpften NE wiederherstellten, was diesen Komplex als einen Mechanismus etablierte, durch den Gal3 in den spleißosomalen Weg rekrutiert wird16. Dies steht im Gegensatz zu Versuchen, Spleißosomen in bestimmten Stadien der Spleißreaktion zu isolieren und die damit verbundenen Faktoren zu katalogisieren17,18. In solchen Studien wird das Vorhandensein bestimmter Faktoren zu einem bestimmten Zeitpunkt festgestellt, nicht jedoch der Mechanismus, durch den sie belastet wurden.
Zuvor hatten wir die Herstellung von NE, das Spleißsubstrat, die Montage des Spleißreaktionsgemisches und die Analyse von Produkten in unserer Dokumentation der Rolle von Galectinen beim Pre-mRNA-Spleißen ausführlich beschrieben19. Wir beschreiben nun die experimentellen Verfahren zur Fraktionierung von Kernextrakten zur Erlangung einer mit Gal3 - U1 snRNP-Komplex angereicherten Fraktion und zur Immunselektion des letzteren Komplexes zur Rekonstitution der Spleißaktivität in einem U1-depletierten Kernextrakt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Komplementierung der Spleißaktivität in Kernextrakt, der an U1-snRNP durch einen Gal3-U1-snRNP-Komplex auf Kügelchen abgereichert ist. (A) NE in Puffer C (NE(C)) wird mit Protein A-Sepharose-Perlen kovalent gekoppelt mit Anti-U1-SnRNP (αU1-Perlen) inkubiert. Der ungebundene Anteil ist an U1 snRNP (U1ΔNE) erschöpft. (B) NE in Puffer D (NE(D)) wird über einen 12%-32%igen Glyceringradienten durch Ultrazentrifugation fraktioniert. Fraktionen, die der 10S-Region (Fraktionen 3-5) entsprechen, werden kombiniert und mit Perlen gemischt, die kovalent mit Anti-Gal3-Antikörpern (αGal3-Perlen) gekoppelt sind. Das an die Kügelchen gebundene Material enthält ein Gal3-U1 snRNP-Monopartikel. (C) Der Gal3-U1 snRNP-Komplex aus Teil (B) wird mit U1ΔNE aus Teil (A) in einem Spleißassay unter Verwendung eines 32P-markierten MINX-Prä-mRNA-Substrats gemischt und die Zwischenprodukte und Produkte der Spleißreaktion werden durch Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-U1 snRNP</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>Hu ENA-RNP #33471</td>
			<td>human autoimmune serum specific for U1 snRNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottle top vacuum filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 431153 (0.22 &#956;m; PES 150 ml)</td>
			<td>for filtering solutions containing Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>International Equipment Company</td>
			<td>IEC Model PR-6</td>
			<td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-5G</td>
			<td>for treatment of water used in preparation of all solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylpimelimidate (DMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80490-5G</td>
			<td>for cross-linking antibody to Sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis cell</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc</td>
			<td>Mini-Protean II</td>
			<td>for SDS-PAGE separation of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411000-100ml</td>
			<td>for blocking after the cross-linking reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>HSI SE 500 Series</td>
			<td>for separating snRNAs by gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel slab dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 224</td>
			<td>for drying gel slabs for autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN3032D (0.2 &#956;m; 30 cm x 3 m)</td>
			<td>for immunoblotting of proteins on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer (12 x 100 &#956;l sample capacity)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Microdialyzer System 100</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer membranes (8K cutoff)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66310</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Spartan Stores</td>
			<td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>for coupling antibody to beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2308-5mg</td>
			<td>for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td>for inhibiting ribonuclease activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker/rotator</td>
			<td>Lab Industries, Inc&#160;</td>
			<td>Labquake Shaker 400-110</td>
			<td>for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Solve</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>No. 111177</td>
			<td>scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation counter</td>
			<td>Beckman Instruments</td>
			<td>LS6000SC</td>
			<td>scintillation counter for determination of radioactivity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed vaccum concentrator</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC 100H</td>
			<td>for drying ethanol-precipitated RNA pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transphor electrophoresis unit</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>Hoefer TE Series Transphor</td>
			<td>for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads

Klassische Depletions-Rekonstitutionsexperimente deuten darauf hin, dass Galectin-3 ein erforderlicher Spleißfaktor in Kernextrakten ist. Der Mechanismus der Integration von Galectin-3 in den Spleißweg wird in diesem Artikel behandelt. Die Sedimentation von HeLa-Zellkernextrakten auf 12%-32% Glyceringradienten ergibt Fraktionen, die in einem endogenen ~10S-Partikel angereichert sind, das Galectin-3 und U1 snRNP enthält. Wir beschreiben nun ein Protokoll zur Depletion von Kernextrakten von U1 snRNP mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität. Die Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt kann durch das Galectin-3 - U1 snRNP-Partikel rekonstituiert werden, das auf Agaroseperlen eingeschlossen ist, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternäre Komplex ein funktioneller E-Komplex ist, der zu Zwischenprodukten und Produkten der Spleißreaktion führt und dass Galectin-3 durch seine Assoziation mit U1 snRNP in den Spleißweg eintritt. Das Schema der Verwendung von Komplexen, affinitäts- oder immunselektioniert auf Kügelchen zur Rekonstitution der Spleißaktivität in Extrakten, die von einem bestimmten Spleißfaktor erschöpft sind, kann allgemein auf andere Systeme anwendbar sein.

NE-depletierte U1-snRNP-Komplexe (U1ΔNE aus Abschnitt 2.2.6) und Gal3-U1-snRNP-Komplexe aus der 10S-Region des Glyceringradientenimimpräzipitats durch Anti-Gal3 (Schritt 3.2.7) wurden in einer Spleißreaktion gemischt. Dieses Reaktionsgemisch enthielt U1-snRNA (Abbildung 2A, Bahn 3) sowie das U1-spezifische Protein U1-70K (Abbildung 2B, Bahn 3). Wie erwartet, fiel der Anti-Gal3 Gal3 aus (Abbildung 2B</stro...

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Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur (a) Depletion von U1 snRNP aus Kernextrakten mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität; und (b) Rekonstitution der Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt durch Galectin-3 - U1-snRNP-Partikel, die an Perlen gebunden sind, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern.

Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

complementation-splicing-activity-galectin-3-u1-snrnp-complex-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

2.1K Aufrufe.  Michigan State University. Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur (a) Depletion von U1 snRNP aus Kernextrakten mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität; und (b) Rekonstitution der Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt durch Galectin-3 - U1-snRNP-Partikel, die an Perlen gebunden sind, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern.

Serie: Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Forschung

Biochemie

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Hydrolyse eines Ni-Schiff-Base-Komplex unter Verwendung von Bedingungen, die für Retention von säurelabilen Schutzgruppen

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes to join exons and remove introns prior to cytoplasmic export of the mature mRNA. Splicing efficiency can be altered by the presence of mutations at splice sites, the influence of trans-acting splicing factors, or the activity of therapeutics. Here, we describe the protocol for a cellular assay that can be applied for monitoring the splicing efficiency of any given exon. The assay uses an adaptable plasmid encoded 3-exon/2-intron minigene reporter, which can be expressed in mammalian cells by transient transfection. Post-transfection, total cellular RNA is isolated, and the efficiency of exon splicing in the reporter mRNA is determined by either primer extension or semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We describe how the impact of disease associated 5&#8242; splice-site mutations can be determined by introducing them in the reporter; and how the suppression of these mutations can be achieved by co-transfection with U1 small nuclear RNA (snRNA) construct carrying compensatory mutations in its 5&#8242; region that basepairs with the 5&#8242;-splice sites at exon-intron junctions in pre-mRNAs. Thus, the reporter can be used for the design of therapeutic U1 particles to improve recognition of mutant 5&#8242; splice-sites. Insertion of cis-acting&#160;regulatory sites, such as splicing enhancer or silencer sequences, into the reporter can also be used to examine the role of U1 snRNP in regulation mediated by a specific alternative splicing factor. Finally, reporter expressing cells can be incubated with small molecules to determine the effect of potential therapeutics on constitutive pre-mRNA splicing or on exons carrying mutant 5&#8242; splice sites. Overall, the reporter assay can be applied to monitor splicing efficiency in a variety of conditions to study fundamental splicing mechanisms and splicing-associated diseases.

This protocol describes a minigene reporter assay to monitor the impact of 5&#180;-splice site mutations on splicing and develops suppressor U1 snRNA for the rescue of mutation-induced splicing inhibition. The reporter and suppressor U1 snRNA constructs are expressed in HeLa cells, and splicing is analyzed by primer extension or RT-PCR.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Erweiterung des Konzentrationsbereichs der Massenphotometrie-Analyse mit Mikrofluidik

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

Autor im Rampenlicht: Charakterisierung von Proteininteraktionen mit geringer Affinität in Lösung mit der MassFluidix-Technologie

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...