Dieses Protokoll kann verwendet werden, um nukleinsäureverkapselte Lipid-Nanopartikel mit hoher Reproduzierbarkeit und Geschwindigkeit und geringen Volumina herzustellen. Die Formulierungsparameter können abgestimmt werden, um eine gewünschte Bioverteilung basierend auf der klinischen Anwendung zu erreichen. Das Standard-Fischgrätendesign der mikrofluidischen Kartusche ermöglicht eine schnelle, präzise und kontrollierte laminare Strömung während des Mischens.
Das Verfahren ist skalierbar und erzeugt gleichmäßige, stark verkapselte Partikel. Da die meisten kommerziell zugelassenen Gentherapieprodukte auf viralen Methoden basieren, kann dieses Verfahren Einblicke in die Genabgabe geben, da sein nicht-viraler Ansatz Anwendungen ermöglicht, für die eine wiederholte Dosierung erforderlich ist. Beginnen Sie mit der Zugabe der entsprechenden Menge jeder flüssigen Stammlösung zu einer Glasfläschchen mit intermittierendem Wirbeln.
wie in der Tabelle angegeben, gefolgt von der Zugabe von 200 Proof-Ethanol zu einem Endvolumen von 533 Mikrolitern. Dann die entsprechende Menge an mRNA-Stamm hinzufügen und mit Citratpuffer verdünnen, um ein Endvolumen von 1,5 Millilitern in der gewünschten Konzentration zu erreichen. Um die mikrofluidischen Kanäle zu grundieren, geben Sie zunächst den Priming-Parameter wie in der Tabelle beschrieben in die Gerätesoftware ein.
Öffnen Sie als Nächstes den Instrumentendeckel und legen Sie eine mikrofluidische Patrone in den rotierenden Block. Laden Sie mindestens 500 Mikroliter Ethanol in eine 1-Milliliter-Spritze, achten Sie darauf, dass sich an der Spritzenspitze keine Blasen oder Luftspalte befinden, und führen Sie die Spritze in den rechten Einlass der Patrone ein. Laden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit 1,5 Milliliter Citratpuffer, achten Sie darauf, dass keine Luftblasen oder Lücken vorhanden sind, und führen Sie die Spritze in den linken Einlass der Patrone ein.
Legen Sie zwei 15 Milliliter konische Rohre in die Cliphalter, die als Abfallbehälter dienen, und klicken Sie auf "Go", um die Lösungen zu mischen. Wenn das Instrument aufhört zu grundieren, wie durch das abschaltende blaue Licht unten angezeigt, öffnen Sie das späte und entsorgen Sie die konischen Röhren und Spritzen ordnungsgemäß. Für die Bildung von Lipidnanopartikeln stellen Sie die entsprechenden Formulierungsparameter wie in der Tabelle angegeben ein und laden Sie eine 1-Milliliter-Spritze mit einer zuvor vorbereiteten Lipidmischung auf.
Entfernen Sie alle Luftspalte oder Blasen in der Spritzenspitze und setzen Sie die Spritze in die rechte Seite der Patrone ein. Laden Sie die zuvor hergestellte Nukleinsäurelösung in eine 3-Milliliter-Spritze, achten Sie darauf, dass sich keine Blasen oder Luftspalte in der Spritzenspitze befinden, und führen Sie die Spritze in den linken Einlass der Patrone ein. Legen Sie ein 15 Milliliter RNAase-freies konisches RNAase-Röhrchen mit dem Probennamen in den linken Röhrchenclip und legen Sie ein 15 Milliliter Abfallkonisch in den rechten Röhrchenclip.
Schließen Sie den Instrumentendeckel und klicken Sie auf Go.Die Lipid- und mRNA-Lösungen fließen durch die mikrofluidische Kartusche und die Lipid-Nanopartikellösung wird in den konischen Röhrchen gesammelt. Behalten Sie das konische Röhrchen am Ende des Formulierungsprozesses bei und verdünnen Sie dann die Lipidnanopartikel mit 5 Millilitern PBS und einer biologischen Sicherheitswerkbank. Um einen Pufferaustausch durchzuführen, waschen Sie zuerst einen 100 Kilodalton Porengroßen-Ultrazentrifugenfilter mit 2 Millilitern PBS, Zentrifuge, vor und entleeren Sie dann das PBS aus dem unteren Fach.
Die verdünnten Lipid-Nanopartikel werden für drei Zentrifugenwäschen in das obere Fach des vorgewaschenen Ultrazentrifugenfilters geben, den Durchfluss entsorgen und dem Ultrazentrifugenfilter nach den ersten beiden Wäschen 5 Milliliter PBS zugefügen. Nach der letzten Wäsche pipetten Sie die Lipid-Nanopartikellösung einige Male gegen die Wände des Ultrazentrifugenfilters, um den Nanopartikelverlust zu minimieren, bevor Sie die Nanopartikellösung in eine nukleasefreie Durchstechflasche überführt. Fügen Sie dann PBS hinzu, um die Nanopartikelsuspension bei Bedarf auf die entsprechende experimentelle Konzentration und das entsprechende Volumen zu bringen.
Um die Verkapselungseffizienz der Lipid-Nanopartikel zu beurteilen, bereiten Sie zunächst zweifache serielle Verdünnungen der arbeitenden Nukleinsäurelösung in PBS vor, um eine Standardkurve zu erzeugen, beginnend mit 500 Nanogramm pro Milliliter und mindestens fünf Verdünnungen. Als nächstes bereiten Sie die Nanopartikelprobenverdünnungen in PBS vor, um eine geeignete theoretische Konzentration zu erreichen, die um den Mittelpunkt der Standardkurve liegt. Bereiten Sie dann das ribogrüne RNA-Reagenz vor, um das Vorhandensein von RNA sowohl innerhalb als auch außerhalb des Lipidnanopartikels nachzuweisen, indem Sie die entsprechenden Mengen an RNA-Reagenz, Triton X100 und PBS mischen.
Um dann das Vorhandensein von RNA außerhalb des flüssigen Nanopartikels nachzuweisen, mischen Sie nur die entsprechenden Mengen an RNA-Reagenzien und PBS. Laden Sie Replikate des Nukleinsäurestandards und Lipid-Nanopartikellösungen in eine schwarze fluoreszenzfähige 96-Well-Platte, fügen Sie dann ein gleiches Volumen an RNA-Quantifizierungsreagenz mit und ohne Triton X100 zum Standard hinzu und proben repliziert. Schütteln Sie die Platte im Plattenleser fünf Minuten lang bei Lichttemperatur, um eine gründliche Durchmischung der Proben zu erhalten, und messen Sie dann die Fluoreszenz auf einem Mikroplattenleser bei einer Anregungswellenlänge von 480 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 520 Nanometern.
Um die hydrodynamische Größe und Polydispersität der Lipid-Nanopartikel zu messen, verdünnen Sie zuerst die Nanopartikellösung 40-mal in PBS und geben Sie die Lösung in eine Halbmikroküvette. Laden Sie die Küvette auf den Zetasizer und wählen Sie ein Standardarbeitsverfahren, um das Instrument so einzustellen, dass die Nanopartikel nach Material, Dispergiermittel, Temperatur und Zelltyp gemessen werden. Klicken Sie dann auf Start", um die hydrodynamische Größe und Polydispergierigkeit der Lipidnanopartikel zu messen.
Um das Zeta-Potential von Lipid-Nanopartikeln zu messen, verdünnen Sie die Nanopartikellösung 40-mal in nukleasefreiem Wasser und laden Sie die Lösung in eine Küvette zur Fülllinie. Laden Sie die Küvette in einen Zeta-Potentialanalysator, achten Sie darauf, dass die Elektroden mit dem Instrument in Kontakt kommen, und stellen Sie das Instrument so ein, dass das Zeta-Potential entsprechend der spezifischen Zusammensetzung der Lipid-Nanopartikel gemessen wird. Klicken Sie dann auf Start", um das Zeta-Lipid-Nanopartikelpotenzial zu messen.
In dieser Analyse wurden an verschiedenen Tagen mehrere Chargen von Lipidnanopartikeln mit der gleichen Lipidformulierung und dem gleichen Amin-Phosphat-Verhältnis entwickelt, um die Reproduzierbarkeit der Technik zu demonstrieren. Wie beobachtet, wiesen die Chargen eins und zwei überlappende Größenverteilungen mit einer ähnlichen Polydispergierigkeit auf, wobei keine signifikanten Unterschiede in der Größe oder Verkapselungseffizienz zwischen den Chargen beobachtet wurden. Typischerweise führen Änderungen der Formulierungsparameter zu kleinen, aber statistisch signifikanten Unterschieden.
Zum Beispiel führt die Verringerung des Amin-Phosphat-Verhältnisses zu einer Abnahme der Verkapselungseffizienz um 4%, mit einer gleichzeitigen Erhöhung des hydrodynamischen Durchmessers der Nanopartikel. Lipid-Nanopartikel, die mit verschiedenen iionisierbaren Lipiden, aber dem gleichen Amin-Phosphat-Verhältnis formuliert sind, weisen eine signifikante Veränderung der Verkapselungseffizienz sowie leichte Unterschiede im Partikeldurchmesser auf. Die Verkapselung von Plasmid-DNA führt zu größeren Partikeln im Vergleich zu mRA-verkapselnden Lipid-Nanopartikeln, obwohl beide Arten von Nanopartikeln eine ähnliche Verkapselungseffizienz aufweisen.
Änderungen des Prozessparameters der Durchflussrate haben jedoch keinen Einfluss auf die Lipid-Nanopartikel-Entwicklung. Lipid-Nanopartikel haben großartige Anwendungen, das perfekte Beispiel sind die kürzlich zugelassenen COVID-19-Impfstoffe. Diese Technik dient als großartiges Werkzeugset und ebnet den Weg für zukünftige Anwendungen, indem sie das Screening der Formulierung unterer Extremitäten ermöglicht.
