Este protocolo se puede utilizar para producir nanopartículas lipídicas encapsuladas en ácido nucleico con alta reproducibilidad y velocidad y bajos volúmenes. Los parámetros de formulación se pueden ajustar para lograr una biodisponsión deseada basada en la aplicación clínica. El diseño estándar de espiga del cartucho microfluídico permite un flujo laminar rápido, preciso y controlado durante la mezcla.
El método es susceptible de escalar y genera partículas uniformes y altamente encapsuladas. Con la mayoría de los productos de terapia génica aprobados comercialmente que se basan en métodos virales, este procedimiento puede proporcionar información sobre la administración de genes, ya que su enfoque no viral permite aplicaciones para las que es necesaria la dosificación repetida. Comience agregando la cantidad adecuada de cada solución de caldo líquido a un vial de vidrio con vórtice intermitente.
como se indica en la tabla, seguido de la adición de 200 etanol a prueba a un volumen final de 533 microlitros. A continuación, añadir la cantidad adecuada de material de ARNm y diluir con tampón de citrato para lograr un volumen final de 1,5 mililitros a la concentración deseada. Para cebar los canales microfluídicos, primero ingrese el parámetro de cebado en el software del instrumento como se describe en la tabla.
A continuación, abra la tapa del instrumento y coloque un cartucho microfluídico en el bloque giratorio. Cargue al menos 500 microlitros de etanol en una jeringa de 1 mililitro, cuidando de que no haya burbujas ni espacios de aire en la punta de la jeringa e inserte la jeringa en la entrada derecha del cartucho. Cargue una jeringa de cinco mililitros con 1,5 mililitros de tampón de citrato, teniendo cuidado de que no haya burbujas de aire ni huecos, e inserte la jeringa en la entrada izquierda del cartucho.
Coloque dos tubos cónicos de 15 mililitros en los soportes de clip para que sirvan como contenedores de residuos y haga clic en "Ir" para mezclar las soluciones. Cuando el instrumento deje de cebarse como lo indica el cierre de la luz azul inferior, abra el último y deseche adecuadamente los tubos cónicos y las jeringas. Para la formación de nanopartículas lipídicas, establezca los parámetros de formulación apropiados como se indica en la tabla y cargue una jeringa de 1 mililitro con una mezcla de lípidos previamente preparada.
Retire los espacios de aire o burbujas en la punta de la jeringa e inserte la jeringa en el lado derecho del cartucho. Cargue la solución de ácido nucleico previamente preparada en una jeringa de 3 mililitros, cuidando de que no haya burbujas ni espacios de aire en la punta de la jeringa, e inserte la jeringa en la entrada izquierda del cartucho. Coloque un tubo cónico libre de RNAsa de 15 mililitros etiquetado con el nombre de la muestra en el clip del tubo izquierdo y coloque un cónico de desecho de 15 mililitros en el clip del tubo derecho.
Cierre la tapa del instrumento y haga clic en Go.Las soluciones de lípidos y ARNm fluirán a través del cartucho microfluídico y la solución de nanopartículas lipídicas se recogerá en los tubos cónicos. Retenga el tubo cónico al final del proceso de formulación, luego diluya las nanopartículas lipídicas con 5 mililitros de PBS y un gabinete de seguridad biológica. Para realizar un intercambio de búfer, primero prelavado un filtro de ultracentrífuga de tamaño de poro de 100 kilodalton con 2 mililitros de PBS, centrífuga y luego vacíe el PBS desde el compartimiento inferior.
Agregue las nanopartículas lipídicas diluidas al compartimento superior del filtro de ultracentrífuga prelavado para tres lavados de centrífuga, descartando el flujo y agregando 5 mililitros de PBS al filtro de ultracentrífuga después de los dos primeros lavados. Después del último lavado, pipetee la solución de nanopartículas lipídicas contra las paredes del filtro de la ultracentrífuga varias veces para minimizar la pérdida de nanopartículas antes de transferir la solución de nanopartículas a un vial libre de nucleasas. Luego agregue PBS para llevar la suspensión de nanopartículas a la concentración y volumen experimental apropiados según sea necesario.
Para evaluar la eficiencia de encapsulación de las nanopartículas lipídicas, primero prepare diluciones seriales dobles de solución de ácido nucleico de trabajo en PBS para generar una curva estándar, comenzando a partir de 500 nanogramos por mililitro y haciendo al menos cinco diluciones. A continuación, prepare las diluciones de muestra de nanopartículas en PBS para lograr una concentración teórica adecuada que se encuentre alrededor del punto medio de la curva estándar. Luego prepare el reactivo de ARN verde ribo para detectar la presencia de ARN tanto dentro como fuera de la nanopartícula lipídica mezclando las cantidades apropiadas de reactivo de ARN, Triton X100 y PBS.
Luego, para detectar la presencia de ARN fuera de la nanopartícula líquida, mezcle las cantidades apropiadas de reactivos de ARN y PBS solamente. La carga se replica de las soluciones estándar de ácido nucleico y nanopartículas lipídicas en una placa de 96 pozos con capacidad de fluorescencia negra, luego agrega un volumen igual de reactivo de cuantificación de ARN con y sin Triton X100 al estándar y replica la muestra. Agite la placa en el lector de placas durante cinco minutos a temperatura ambiente protegida de la luz para obtener una mezcla completa de las muestras, luego mida la fluorescencia en un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 480 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 520 nanómetros.
Para medir el tamaño hidrodinámico y la polidispersión de las nanopartículas lipídicas, primero diluya la solución de nanopartículas 40 veces en PBS y agregue la solución a una semi micro cubeta. Cargue la cubeta en el Zetasizer y seleccione un procedimiento operativo estándar para configurar el instrumento para medir las nanopartículas de acuerdo con su material, dispersante, temperatura y tipo de célula. A continuación, haga clic en Iniciar" para medir el tamaño hidrodinámico y la polidisparidad de las nanopartículas lipídicas.
Para medir el potencial Zeta de las nanopartículas lipídicas, diluya la solución de nanopartículas 40 veces en agua libre de nucleasas y cargue la solución en una cubeta hasta la línea de llenado. Cargue la cubeta en un analizador de potencial Zeta, teniendo cuidado de que los electrodos entren en contacto con el instrumento, y configure el instrumento para medir el potencial Zeta de acuerdo con la composición específica de las nanopartículas lipídicas. Luego haga clic en Inicio" para medir el potencial de nanopartículas lipídicas Zeta.
En este análisis, se desarrollaron múltiples lotes de nanopartículas lipídicas con la misma formulación lipídica y proporción de amina a fosfato en días separados para demostrar la reproducibilidad de la técnica. Como se observó, los lotes uno y dos exhibieron distribuciones de tamaño superpuestas con una dispersión poli similar, sin que se observaran diferencias significativas en el tamaño o la eficiencia de encapsulación entre los lotes. Por lo general, los cambios en los parámetros de formulación inducen algunas diferencias pequeñas pero estadísticamente significativas.
Por ejemplo, la disminución de la relación amina-fosfato da como resultado una disminución del 4% en la eficiencia de encapsulación, con un aumento concomitante en el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas. Las nanopartículas lipídicas formuladas con diferentes lípidos ionizables pero la misma proporción de amina a fosfato, exhiben un cambio significativo en la eficiencia de encapsulación, así como ligeras diferencias en el diámetro de la partícula. La encapsulación del ADN plásmido da como resultado partículas más grandes en comparación con las nanopartículas lipídicas encapsulantes de mRA, aunque ambos tipos de nanopartículas demuestran una eficiencia de encapsulación similar.
Sin embargo, los cambios en el parámetro del proceso de caudal no afectan el desarrollo de nanopartículas lipídicas. Las nanopartículas lipídicas tienen grandes aplicaciones, siendo el ejemplo perfecto las vacunas COVID-19 recientemente aprobadas. Esta técnica sirve como un gran conjunto de herramientas y allana el camino para futuras aplicaciones al permitir la detección de formulaciones de miembros inferiores.
