Dieses Protokoll gehört zu den ersten, die die Verwendung eines Autoinjektorapparats bei der Drosophila-Tumorallotransplantation beschreiben. Ein Thema, das in den letzten Jahren an Popularität gewonnen hat. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die Effizienz der Krebsforschung in Drosophila erhöht, indem sie die Geschwindigkeit, Konsistenz und Ausbeute der Tumorallotransplantation verbessert.
Die Tumorallotransplantation bei Drosophila ist eine heikle Technik, die schwer zu beherrschen sein kann. Seien Sie geduldig und vertrauen Sie darauf, dass Übung den Meister macht. Nachdem Sie die Fliegen gekreuzt und die Eier sechs Tage lang bei 18 Grad Celsius bebrütet haben, bringen Sie die Fläschchen mit den geschlüpften Larven in einen Inkubator bei 29 Grad Celsius.
Sortieren Sie den betäubten Wildtyp oder die mutierten erwachsenen Fliegen nach ihrem Geschlecht. Befestigen Sie ein fünf Zentimeter langes Stück Fliegenband an einem Objektträger mit der klebrigen Seite nach oben. Immobilisieren Sie die Fliegen, indem Sie ihre Flügel mit einer Pinzette an das Band kleben.
Platzieren Sie die Reglerbox und den Autoinjektor auf gegenüberliegenden Seiten des Lichtmikroskops. Verarbeiten Sie ein Ende der Glaskapillare mit einem vierstufigen Mikropipettenabzieher und erhitzen Sie es auf ein schmales geschlossenes Ende. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Kapillare in einem Winkel von etwa 60 Grad zu befestigen, um eine 3,5-Zoll-Glaskapillare vorzubereiten.
Schrauben Sie die Kappe des Injektors leicht ab. Halten Sie die leere Taste gedrückt, um die Injektornadel so lange zu bewegen, bis 70 bis 80 % der Gesamtlänge angezeigt werden. Verwenden Sie eine Spritze, um die Glaskapillare mit Mineralöl zu füllen.
Wählen Sie eine der Larven und übertragen Sie sie auf eine Dissektionsplatte, die mit 100 Mikrolitern Schneider's Medium gefüllt ist, um sich auf die SG-Ringtumordissektion vorzubereiten. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Mittelteil des Larvenkörpers zu halten, klemmen Sie den Larvenkopf mit einer anderen Pinzette ein und üben Sie eine Dehnungskraft in Längsrichtung aus. Lokalisieren und isolieren Sie das Y-förmige SG der Larven und sezieren Sie dann den SG-imaginären Ringtumor, indem Sie das angrenzende Gewebe entfernen.
Füllen Sie die Glaskapillare mit Schneiders Medium bis zum oberen 0,5-Zentimeter-Segment, indem Sie die Fülltaste gedrückt halten. Suchen Sie einen Primärtumor und drücken Sie die Fülltaste, bis der Tumor in die Kapillare abgesaugt wird. Stellen Sie sicher, dass der Tumor an der Spitze der Kapillare oder mehrere Millimeter von der Spitze der Kapillare entfernt sitzt.
Suchen Sie eine erwachsene Fliege, die am Band immobilisiert ist. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um den Unterbauch vorsichtig festzuhalten und die untere laterale Kutikula des Abdomens mit der Kapillare zu durchstechen. Drücken Sie die leere Taste, bis der Tumor in den neuen Wirtsbauch gelangt.
Drücken Sie die Flügel des Hosts mit einer Pinzette vorsichtig nach oben, um sie vom Band zu entfernen. Dann legen Sie es in eine neue Durchstechflasche mit frischen Lebensmitteln. Screenen Sie nach Tumoren, die etwa 10 bis 14 Tage nach dem Allographen mit einem Fluoreszenzmikroskop im Wirtsbauch gewachsen sind, und sezieren Sie den gewachsenen allotransplantierten Tumor mit zwei Pinzettenpaaren aus dem Wirt.
Verwenden Sie ein Paar Pinzetten, um den Bauch festzuhalten, und das andere Paar, um die Bauchkutikula aufzuschneiden und den allotransplantierten Tumor freizulegen. Isolieren Sie den Tumor vorsichtig von den angeschlossenen Wirtsgeweben. Verwenden Sie sterile Nadeln und zerlegen Sie die Tumore in kleinere Stücke, die für die Kapillargröße geeignet sind.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine neue Generation von erwachsenen Wirten, um die Allotransplantation des Tumors abzuschließen. Der Prozess der Tumorentwicklung wurde durch Live-Bildgebung eines imaginären SG-Ringtumors der ersten Generation verfolgt, der am 10. Tag nach der Allotransplantation in einem erwachsenen Wirtsbauch wuchs. Ein imaginärer SG-Ringtumor der sechsten Generation, der am 10. Tag einen großen Teil des Wirtsabdomens einnimmt, wird hier nach der Allotransplantation gezeigt.
Die Bildgebung in diesem Stadium kann dazu beitragen, Tumorwachstumsmuster sowie sein Migrations- und Invasionsverhalten aufzudecken. Die Tumortransplantation ist eine großartige Technik für Längsschnittstudien zur Tumorprogression, Evolution und Metastasierung. Ergebnisse von großer Bedeutung für die Untersuchung von Tumor-Wirts-Interaktionen.
Dieses Proto hat ein großes Potenzial in Krebsmedikamenten Screenings mit den Medikamenten Temodal. Mit dieser Technik können Forscher viel Zeit und Mühe bei der Untersuchung sparen.
