Dieses Protokoll wird die Verwendung von Einzelzell-RNA-seq für die anfängliche Phänotypisierung ermöglichen. Und, in Kombination mit Einzelzell-ATAC-seq, die Rekonstruktion genregulatorischer Netzwerke. Die Verwendung von MULTI-seq hält die Kosten für die Erstuntersuchung niedrig, und die Fixierung von gepaarten Proben für Einzelzell-RNA-seq und Einzelzell-ATAC-seq ermöglicht die Zeitverlaufsanalyse von genregulatorischen Netzwerken.
Forscher können dieses Protokoll verwenden, um die genetischen Netzwerke zu verstehen, die die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit steuern. Fügen Sie zunächst 20 Mikroliter Anker-Barcode-Lösung zu jeder Probe hinzu und pipetten Sie sie, um sie zu mischen. Inkubieren Sie es fünf Minuten auf Eis.
Dann fügen Sie 20 Mikroliter Co-Ankerlösung zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie weitere fünf Minuten auf Eis. Fügen Sie jeder Probe einen Milliliter eiskaltes 1% BSA und PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
Dann fügen Sie 400 Mikroliter eiskaltes 1% BSA und PBS hinzu. Zentrifugieren bei 300 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen für jede Probe mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und das Volumen, die für Gel Bead-in-Emulsion oder GEM erforderlich sind.
Kombinieren Sie die berechneten Volumina aus jeder Probe in einem neuen sterilen 1,5-Milliliter-Röhrchen und bestimmen Sie die endgültige Zellkonzentration der kombinierten Proben. Führen Sie nach der GEM-Generierung und dem Barcoding eine Genexpressions-cDNA-Bereinigung mithilfe der Größenauswahl durch, wobei Sie sicherstellen, dass der Überstand aus der ersten Auswahlrunde, der den Probenbarcode enthält, nicht verworfen wird. Der Überstand wird in ein neues steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und auf Eis gelagert.
Wirbeln Sie das paramagnetische Perlen-basierte Größenauswahlreagenz und fügen Sie 260 Mikroliter des Reagenzes und 180% Isopropanol zum Überstand hinzu. Die Mischung 10 Mal pipetten und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Röhrchen auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Lösung gelöscht ist.
Sobald die Lösung klar ist, entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 Mikroliter 80% Ethanol für 30 Sekunden zu den Perlen hinzu und verwerfen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Wäschen.
Zentrifugieren Sie die Perlen kurz und bringen Sie sie in das Magnetgestell zurück. Stellen Sie den Timer auf zwei Minuten ein. Entfernen Sie dann das restliche Ethanol mit einer P10-Pipette und trocknen Sie die Perlen auf dem Magnetgestell für die restlichen zwei Minuten an der Luft.
Entfernen Sie die Perlen aus dem Magnetgestell und resuspendieren Sie sie in 100 Mikroliter Elutionspuffer. Pipettieren Sie gründlich, um sie zu resuspendieren, und inkubieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur, dann bringen Sie die Perlen in das Magnetgestell zurück und warten Sie, bis die Lösung klar ist. Den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Wiederholen Sie die Bereinigung wie gezeigt, wobei Sie das halbe Volumen des Elutionspuffers verwenden. Für die Proben, die für die scATAC-Sequenz bestimmt sind, entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer P200-Pipette und frieren Sie die Proben in Ethanol-Trockeneis ein. Um die Zellen in den Proben, die für die scRNA-Sequenzierung bestimmt sind, zu dissoziieren, führen Sie die Dissoziationsschritte mit Papain durch, wie im Textmanuskript beschrieben.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für drei Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie einen Milliliter gekühltes PBS hinzu und mischen Sie 10 mal oder bis die Zellen vollständig suspendiert sind. Auch hier bei 300 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und die Wäsche mit PBS zweimal wiederholen.
Beginnen Sie mit dem Wirbeln des Röhrchens mit der niedrigsten Geschwindigkeitseinstellung und fügen Sie 900 Mikroliter gekühltes Methanol Tropfen für Tropfen hinzu, während Sie das Rohr weiterhin sanft wirbeln, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten auf Eis. Bestimmen Sie die Konzentration der fixierten Zellen mit einem Hämozytometer und beurteilen Sie die Wirksamkeit des Fixierungsschritts mit Trypanblau.
Lagern Sie das gefrorene Gewebe und die fixierten Zellen bei minus 80 Grad Celsius. MULTI-Sequenz-Barcoding ermöglicht die kombinierte Sequenzierung mehrerer Proben und deren anschließende rechnerische Dekonvolution. Die Herkunftsprobe kann für jede Zelle anhand ihres Barcode-Ausdrucks bestimmt werden.
Diese kombinierten Proben können als ein einziger Datensatz zum Zwecke des Zellclusterings und der Zelltypidentifizierung analysiert werden. Da jede Zelle vor der GEM-Generierung mit einem Barcode versehen wird, haben Zelldubletten eine hohe Wahrscheinlichkeit, Ausdruck für mehrere MULTI-Sequenz-Barcodes zu zeigen, und eine Mehrheit der Dubletten kann daher vor dem Clustering und der Zelltypidentifizierung identifiziert und entfernt werden. Die Einzelzell-ATAC-Sequenzierung kann verwendet werden, um einen Datensatz mit Zelltypen zu generieren, die denen der Einzelzell-RNA-Sequenzierung entsprechen.
Die Paarung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungs-Genexpressions- und Einzelzell-ATAC-Sequenzierungs-DNA-Zugänglichkeitsinformationen ermöglicht die Rekonstruktion genregulatorischer Netzwerke. Beachten Sie beim Versuch des Protokolls, dass das zweiminütige Timing der Ethnolverdampfung entscheidend für den Sequenzabruf in den nachfolgenden Elutionsschritten ist. Die Rekonstruktion genregulatorischer Netzwerke unter Verwendung von gepaarten Einzelzell-RNA-seq und Einzelzell-ATAC-seq erzeugt Ziele für Gen-Überexpressions- und Knockout-Studien.
MULTI-seq kann in diesem Stadium eingesetzt werden, um zelltypspezifische Effekte zu identifizieren.
