Ce protocole permettra l’utilisation d’un séquençage d’ARN unicellulaire pour le phénotypage initial. Et, lorsqu’il est associé à un ATAC-seq unicellulaire, la reconstruction de réseaux de régulation génique. L’utilisation de MULTI-seq maintient les coûts bas pour l’investigation initiale, et la fixation d’échantillons appariés pour le séquençage d’ARN unicellulaire et le séquençage ATAC unicellulaire permet une analyse temporelle des réseaux de régulation génique.
Les chercheurs peuvent utiliser ce protocole pour comprendre les réseaux génétiques contrôlant le développement et la progression de la maladie. Pour commencer, ajoutez 20 microlitres de solution de code-barres d’ancrage à chaque échantillon et pipetez-le pour mélanger. Incuber sur la glace pendant cinq minutes.
Ajoutez ensuite 20 microlitres de solution de co-ancrage à chaque échantillon et incuber sur de la glace pendant cinq minutes supplémentaires. Ajouter un millilitre de 1% de BSA et de PBS glacés à chaque échantillon et centrifuger les cellules à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant sans déranger la pastille de cellule.
Ajoutez ensuite 400 microlitres de glaçon 1% BSA et PBS. Centrifuger à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Déterminer la concentration de cellules pour chaque échantillon à l’aide d’un hémocytomètre et calculer le nombre total de cellules et le volume requis pour le Gel Bead-In-Emulsion ou GEM.
Combinez les volumes calculés de chaque échantillon dans un nouveau tube stérile de 1,5 millilitre et déterminez la concentration cellulaire finale des échantillons combinés. Après la génération du GEM et le codage à barres, effectuer le nettoyage de l’ADNc d’expression génique en utilisant la sélection de la taille, en veillant à ne pas jeter le surnageant du premier tour de sélection, qui contient le code-barres de l’échantillon. Transférez le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre et stockez-le sur de la glace.
Vortex le réactif de sélection de taille à base de billes paramagnétiques et ajouter 260 microlitres du réactif et 180 microlitres d’isopropanol à 100% au surnageant. Pipeter le mélange 10 fois et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Placez le tube sur une grille magnétique et attendez que la solution soit effacée.
Une fois que la solution est claire, retirez et jetez le surnageant. Ajouter 500 microlitres d’éthanol à 80% aux billes pendant 30 secondes, puis jeter le surnageant. Répétez cette opération pour un total de deux lavages.
Centrifuger brièvement les billes et les remettre dans le rack magnétique. Réglez la minuterie sur deux minutes. Ensuite, retirez l’éthanol résiduel avec une pipette P10 et séchez à l’air libre les billes sur la grille magnétique pendant les deux minutes restantes.
Retirez les billes du support magnétique et remettez-les en suspension dans 100 microlitres de tampon d’élution. Pipeter soigneusement pour remettre en suspension et incuber à température ambiante pendant deux minutes, puis remettre les billes dans la grille magnétique et attendre que la solution se dissipe. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.
Répéter le nettoyage comme indiqué, en utilisant la moitié du volume de tampon d’élution. Pour les échantillons destinés à la séquence scATAC, retirer tout liquide du tube microcentrifuge à l’aide d’une pipette P200 et congeler les échantillons dans de la glace sèche à l’éthanol. Pour dissocier les cellules dans les échantillons destinés au séquençage de l’ARNsc, effectuez les étapes de dissociation en utilisant la papaïne, comme décrit dans le manuscrit.
Centrifuger les cellules à 300 x g pendant trois minutes à température ambiante et retirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Ajouter un millilitre de PBS réfrigéré et mélanger 10 fois ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement suspendues. Encore une fois, centrifuger à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et répéter le lavage avec PBS deux fois.
Commencez à faire tourbillonner le tube à la vitesse la plus basse et ajoutez 900 microlitres de méthanol réfrigéré, goutte à goutte, tout en continuant à vorter doucement le tube pour empêcher les cellules de s’agglutiner. Incuber les cellules sur la glace pendant 15 minutes. Déterminer la concentration des cellules fixes à l’aide d’un hémocytomètre et évaluer l’efficacité de l’étape de fixation à l’aide du bleu de trypan.
Conservez les tissus congelés et les cellules fixes à moins 80 degrés Celsius. Le codage à barres MULTI permet le séquençage combiné de plusieurs échantillons et leur déconvolution computationnelle ultérieure. L’échantillon d’origine peut être déterminé pour chaque cellule en fonction de leur expression de code-barres.
Ces échantillons combinés peuvent être analysés comme un seul ensemble de données aux fins du regroupement cellulaire et de l’identification du type de cellule. Étant donné que chaque cellule est codée à barres avant la génération GEM, les doublets cellulaires auront une forte probabilité de montrer l’expression de plusieurs codes-barres de séquence MULTI, et une majorité de doublets peuvent donc être identifiés et supprimés avant le regroupement et l’identification du type de cellule. Le séquençage ATAC unicellulaire peut être utilisé pour générer un ensemble de données avec des types de cellules correspondant à ceux trouvés par le séquençage d’ARN unicellulaire.
L’appariement de l’expression génique de séquençage de l’ARN unicellulaire et de l’information sur l’accessibilité de l’ADN du séquençage ATAC unicellulaire permet la reconstruction des réseaux de régulation des gènes. Lorsque vous essayez le protocole, gardez à l’esprit que le moment de deux minutes de l’évaporation ethnol est crucial pour la récupération de la séquence dans les étapes d’élution suivantes. La reconstruction de réseaux de régulation génique à l’aide d’un séquençage d’ARN unicellulaire apparié et d’un séquen-seq ATAC unicellulaire produit des cibles pour les études sur la surexpression génique et l’élimination des gènes.
MULTI-seq peut être utilisé à ce stade pour identifier les effets spécifiques du type cellulaire.
