Questo protocollo consentirà l'uso di RNA-seq a singola cellula per la fenotipizzazione iniziale. E, se abbinato ad ATAC-seq a singola cellula, la ricostruzione delle reti di regolazione genica. L'uso di MULTI-seq mantiene bassi i costi per l'indagine iniziale e il fissaggio di campioni accoppiati per RNA-seq a singola cellula e ATAC-seq a singola cellula consente l'analisi del decorso temporale delle reti di regolazione genica.
I ricercatori possono utilizzare questo protocollo per comprendere le reti genetiche che controllano lo sviluppo e la progressione della malattia. Per iniziare, aggiungere 20 microlitri di soluzione di codice a barre di ancoraggio a ciascun campione e pipettarlo per miscelare. Incubarlo sul ghiaccio per cinque minuti.
Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione di co-ancoraggio a ciascun campione e incubare sul ghiaccio per altri cinque minuti. Aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo 1% BSA e PBS a ciascun campione e centrifugare le cellule a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
Quindi aggiungere 400 microlitri di ghiaccio freddo 1% BSA e PBS. Centrifugare a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Determinare la concentrazione di cellule per ciascun campione utilizzando un emocitometro e calcolare il numero totale di cellule e il volume richiesto per Gel Bead-in-Emulsion o GEM.
Combinare i volumi calcolati da ciascun campione in una nuova provetta sterile da 1,5 millilitri e determinare la concentrazione cellulare finale dei campioni combinati. Dopo la generazione del GEM e il codice a barre, eseguire la pulizia del cDNA dell'espressione genica utilizzando la selezione delle dimensioni, assicurandosi di non scartare il surnatante dal primo ciclo di selezione, che contiene il codice a barre del campione. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservarlo su ghiaccio.
Vortice il reagente di selezione delle dimensioni basato su perline paramagnetiche e aggiungere 260 microlitri di reagente e 180 microlitri di isopropanolo al 100% al surnatante. Pipettare la miscela 10 volte e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Posizionare il tubo su un rack magnetico e attendere che la soluzione si chiuda.
Una volta che la soluzione è chiara, rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 500 microlitri di etanolo all'80% alle perline per 30 secondi, quindi scartare il surnatante. Ripeti questa operazione per un totale di due lavaggi.
Centrifugare brevemente le perle e rimetterle sul rack magnetico. Impostare il timer su due minuti. Quindi rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta P10 e asciugare all'aria le perle sul rack magnetico per i restanti due minuti.
Rimuovere le perle dal rack magnetico e risospenderle in 100 microlitri di tampone di eluizione. Pipettare accuratamente per risospendere e incubare a temperatura ambiente per due minuti, quindi riportare le perle sul rack magnetico e attendere che la soluzione si chiuda. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Ripetere la pulizia come dimostrato, utilizzando metà del volume del buffer di eluizione. Per i campioni destinati alla sequenza scATAC, rimuovere qualsiasi liquido dalla provetta della microcentrifuga utilizzando una pipetta P200 e congelare i campioni in ghiaccio secco di etanolo. Per dissociare le cellule nei campioni destinati al sequenziamento di scRNA, eseguire le fasi di dissociazione utilizzando la papaina, come descritto nel manoscritto testuale.
Centrifugare le cellule a 300 x g per tre minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare. Aggiungere un millilitro di PBS refrigerato e mescolare 10 volte o fino a quando le celle sono completamente sospese. Anche in questo caso, centrifugare a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e ripetere il lavaggio con PBS due volte.
Inizia a vorticare il tubo alla velocità più bassa e aggiungi 900 microlitri di metanolo refrigerato, goccia a goccia, continuando a vorticare delicatamente il tubo per evitare che le cellule si aggreghino. Incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti. Determinare la concentrazione delle cellule fisse utilizzando un emocitometro e valutare l'efficacia della fase di fissazione utilizzando il tripano blu.
Conservare il tessuto congelato e le cellule fisse a meno 80 gradi Celsius. Il codice a barre MULTI sequence consente il sequenziamento combinato di più campioni e la loro successiva deconvoluzione computazionale. Il campione di origine può essere determinato per ogni cella in base alla loro espressione di codice a barre.
Questi campioni combinati possono essere analizzati come un singolo set di dati ai fini del clustering cellulare e dell'identificazione del tipo di cellula. Poiché ogni cella è codificata a barre prima della generazione GEM, i doppietti cellulari avranno un'alta probabilità di mostrare espressione per più codici a barre MULTI sequenza e la maggior parte dei doppietti può quindi essere identificata e rimossa prima del clustering e dell'identificazione del tipo di cella. Il sequenziamento ATAC a cellula singola può essere utilizzato per generare un set di dati con tipi di cellule che corrispondono a quelli trovati dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
L'accoppiamento dell'espressione genica di sequenziamento dell'RNA a singola cellula e delle informazioni sull'accessibilità del DNA del sequenziamento ATAC a singola cellula consente la ricostruzione delle reti di regolazione genica. Quando si tenta il protocollo, tenere presente che la tempistica di due minuti dell'evaporazione dell'etnolo è cruciale per il recupero della sequenza nelle successive fasi di eluizione. La ricostruzione delle reti di regolazione genica utilizzando RNA-seq unicellulare accoppiato e ATAC-seq a singola cellula produce bersagli per studi di sovraespressione genica e knockout.
MULTI-seq può essere impiegato in questa fase per identificare gli effetti specifici del tipo di cellula.
