이 프로토콜은 초기 표현형을 위해 단일 세포 RNA-seq의 사용을 가능하게 합니다. 그리고 단일 세포 ATAC-seq와 쌍을 이루면 유전자 조절 네트워크가 재구성됩니다. MULTI-seq를 사용하면 초기 조사 비용이 낮게 유지되고 단일 세포 RNA-seq 및 단일 세포 ATAC-seq에 대해 쌍을 이루는 샘플을 고정하면 유전자 조절 네트워크의 시간 경과 분석이 가능합니다.
조사관은 이 프로토콜을 활용하여 발달 및 질병 진행을 제어하는 유전 네트워크를 이해할 수 있습니다. 시작하려면 각 샘플에 20마이크로리터의 앵커 바코드 용액을 추가하고 피펫으로 혼합하여 혼합합니다. 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 각 샘플에 20 마이크로 리터의 공동 앵커 용액을 추가하고 얼음에서 5 분 더 배양합니다. 각 샘플에 얼음처럼 차가운 1%BSA 및 PBS 1밀리리터를 추가하고 섭씨 4도에서 5분 동안 300 x g에서 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거한다.
그런 다음 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA와 PBS를 첨가하십시오. 섭씨 4도에서 5분 동안 300 x g로 원심분리합니다. 혈구계를 사용하여 각 샘플의 세포 농도를 결정하고 겔 비드 인 에멀젼 또는 GEM에 필요한 총 세포 수와 부피를 계산합니다.
각 샘플에서 계산된 부피를 새로운 멸균 1.5 밀리리터 튜브에 결합하고 결합된 샘플의 최종 세포 농도를 결정합니다. GEM 생성 및 바코딩 후, 크기 선택을 사용하여 유전자 발현 cDNA 클린업을 수행하고, 샘플 바코드가 포함된 첫 번째 선택 라운드에서 상청액을 버리지 않도록 합니다. 상청액을 새로운 멸균 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 얼음에 보관하십시오.
상자성 비드 기반 크기 선택 시약을 와동시키고, 260 마이크로리터의 시약 및 180 마이크로리터의 100% 이소프로판올을 상청액에 첨가한다. 혼합물을 10 번 피펫팅하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 용액이 깨끗해질 때까지 기다립니다.
용액이 깨끗해지면 상청액을 제거하고 폐기하십시오. 500 마이크로 리터의 80 % 에탄올을 비드에 30 초 동안 첨가 한 다음 상청액을 버립니다. 총 두 번 세척 할 때이 작업을 반복하십시오.
비드를 간단히 원심 분리하고 마그네틱 랙으로 되돌립니다. 타이머를 2분으로 설정합니다. 그런 다음 P10 피펫으로 잔류 에탄올을 제거하고 나머지 2분 동안 마그네틱 랙에서 비드를 자연 건조시킵니다.
마그네틱 랙에서 비드를 제거하고 100마이크로리터의 용리 버퍼에 재현탁합니다. 피펫을 완전히 재현탁하고 실온에서 2분 동안 배양한 다음 비드를 마그네틱 랙으로 되돌리고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다. 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
용리 버퍼 부피의 절반을 사용하여 설명된 대로 정리를 반복합니다. scATAC 시퀀스로 향하는 샘플의 경우 P200 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 액체를 제거하고 에탄올 드라이 아이스에서 샘플을 급속 동결합니다. scRNA 시퀀싱으로 향하는 샘플에서 세포를 해리하려면 텍스트 원고에 설명된 대로 파파인을 사용하여 해리 단계를 수행합니다.
세포를 실온에서 3분 동안 300 x g으로 원심분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거한다. 식힌 PBS 1 밀리리터를 넣고 10 회 또는 세포가 완전히 현탁 될 때까지 혼합합니다. 다시, 섭씨 4도에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하고, PBS로 세척을 2회 반복한다.
최저 속도 설정에서 튜브를 소용돌이 치고 900 마이크로 리터의 냉각 메탄올을 한 방울 씩 첨가하면서 튜브를 부드럽게 와류하여 세포가 뭉치는 것을 방지합니다. 세포를 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오. 혈구계를 이용하여 고정된 세포의 농도를 결정하고, 트리판 블루를 이용하여 고정 단계의 효능을 평가하였다.
냉동 된 조직과 고정 된 세포를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. MULTI 시퀀스 바코드는 여러 샘플의 결합된 시퀀싱과 후속 계산 디콘볼루션을 가능하게 합니다. 원산지 샘플은 바코드 표현식을 기반으로 각 셀에 대해 결정될 수 있습니다.
이러한 결합된 샘플은 세포 클러스터링 및 세포 유형 식별을 위해 단일 데이터 세트로 분석할 수 있습니다. 각 세포는 GEM 생성 전에 바코드되기 때문에 세포 이중선은 여러 MULTI 서열 바코드에 대한 발현을 나타낼 가능성이 높으므로 클러스터링 및 세포 유형 식별 전에 대부분의 이중선을 식별하고 제거할 수 있습니다. 단일 세포 ATAC 시퀀싱을 사용하여 단일 세포 RNA 시퀀싱에서 찾은 것과 일치하는 세포 유형의 데이터 세트를 생성할 수 있습니다.
단일 세포 RNA 시퀀싱 유전자 발현과 단일 세포 ATAC 시퀀싱 DNA 접근성 정보의 쌍은 유전자 조절 네트워크의 재구성을 가능하게 합니다. 프로토콜을 시도할 때 에놀 증발의 2분 타이밍이 후속 용리 단계에서 서열 검색에 중요하다는 점을 명심하십시오. 쌍을 이루는 단일 세포 RNA-seq 및 단일 세포 ATAC-seq를 사용하여 유전자 조절 네트워크를 재구성하면 유전자 과발현 및 녹아웃 연구를 위한 표적이 생성됩니다.
이 단계에서 MULTI-seq를 사용하여 세포 유형 특이적 효과를 확인할 수 있습니다.
