Este protocolo permitirá o uso de RNA-seq unicelular para fenotipagem inicial. E, quando emparelhado com ATAC-seq unicelular, a reconstrução de redes de regulação genética. O uso de MULTI-seq mantém os custos baixos para investigação inicial, e a fixação de amostras emparelhadas para RNA-seq de células únicas e ATAC-seq unicelulares permite a análise do curso de tempo das redes reguladoras genéticas.
Os pesquisadores podem utilizar esse protocolo para entender as redes genéticas que controlam o desenvolvimento e a progressão da doença. Para começar, adicione 20 microliters de solução de código de barras âncora a cada amostra e pipete-a para misturar. Incubar no gelo por cinco minutos.
Em seguida, adicione 20 microliters de solução co-âncora a cada amostra, e incubar no gelo por mais cinco minutos. Adicione um mililitro de gelo frio 1%BSA e PBS para cada amostra e centrifugar as células a 300 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular.
Em seguida, adicione 400 microliters de gelo frio 1%BSA e PBS. Centrifugar a 300 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Determine a concentração de células para cada amostra usando um hemótmetro e calcule o número total de células e volume necessários para Gel Bead-in-Emulsion ou GEM.
Combine os volumes calculados de cada amostra em um novo tubo estéril de 1,5 mililitro, e determine a concentração celular final das amostras combinadas. Após a geração GEM e a codificação de barras, realize a limpeza cDNA de expressão genética usando a seleção de tamanho, certificando-se de não descartar o supernatante da primeira rodada de seleção, que contém o código de barras da amostra. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e guarde-o no gelo.
Vórtice o reagente de tamanho paramagnético baseado em contas, e adicionar 260 microliters do reagente e 180 microlitres de 100% Isopropanol ao supernante. Pipeta a mistura 10 vezes e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Coloque o tubo em um rack magnético e espere a solução clarear.
Uma vez que a solução esteja clara, remova e descarte o sobrenatante. Adicione 500 microliters de 80% de etanol às contas por 30 segundos e descarte o supernatante. Repita isso para um total de duas lavagens.
Centrifufique brevemente as contas e devolva-as ao rack magnético. Defina o temporizador para dois minutos. Em seguida, remova o etanol residual com uma pipeta P10 e seque as contas no rack magnético durante os dois minutos restantes.
Remova as contas do rack magnético e resuspense-as em 100 microliters de tampão de eluição. Pipeta bem para resuspend, e incubar à temperatura ambiente por dois minutos, em seguida, retornar as contas para o rack magnético e esperar a solução para limpar. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro fresco.
Repita a limpeza como demonstrado, utilizando metade do volume do tampão de eluição. Para as amostras destinadas à sequência scATAC, remova qualquer líquido do tubo de microcentrifuutura usando uma pipeta P200 e congele as amostras em gelo seco de etanol. Para dissociar as células nas amostras destinadas ao sequenciamento de scRNA, realize as etapas de dissociação utilizando papain, conforme descrito no manuscrito do texto.
Centrifugar as células a 300 x g por três minutos à temperatura ambiente, e remova o sobrenante sem interromper a pelota celular. Adicione um mililitro de PBS refrigerado, e misture 10 vezes ou até que as células estejam completamente suspensas. Novamente, centrífuga a 300 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius, e repita a lavagem com PBS duas vezes.
Comece a vórtice do tubo na configuração de velocidade mais baixa e adicione 900 microliters de metanol resfriado, gota a gota, enquanto continua a suavemente vórtice do tubo para evitar que as células se desprentemem. Incubar as células no gelo por 15 minutos. Determine a concentração das células fixas usando um hemócito e avalie a eficácia da etapa de fixação usando o azul trypan.
Armazene o tecido congelado e as células fixas a menos 80 graus Celsius. A codificação de sequência MULTI permite o sequenciamento combinado de várias amostras e sua subsequente desconvolução computacional. A amostra de origem pode ser determinada para cada célula com base em sua expressão de código de barras.
Essas amostras combinadas podem ser analisadas como um único conjunto de dados para fins de agrupamento celular e identificação do tipo celular. Como cada célula é codificada antes da geração GEM, os doublets de célula terão uma alta probabilidade de mostrar expressão para vários códigos de barras de sequência MULTI, e a maioria dos doublets pode, portanto, ser identificada e removida antes do agrupamento e identificação do tipo celular. O sequenciamento ATAC unicelular pode ser usado para gerar um conjunto de dados com tipos de células para coincidir com os encontrados pelo sequenciamento de RNA unicelular.
O emparelhamento de RNA unicelular sequenciando expressão genética e atac unicelular sequenciando informações de acessibilidade de DNA permite a reconstrução de redes reguladoras genéticas. Ao tentar o protocolo, tenha em mente que o tempo de dois minutos da evaporação etnol é crucial para a recuperação de sequência nas etapas de eluição subsequentes. A reconstrução de redes reguladoras genéticas usando RNA-seq unicelulares emparelhadas e ATAC-seq unicelulares produz metas para superexpressão genética e estudos eliminatórios.
Multi-seq pode ser empregado nesta fase para identificar efeitos específicos do tipo celular.
