このプロトコルにより、初期表現型にシングルセルRNA-seqを使用できるようになります。そして、シングルセルATAC-seqと組み合わせると、遺伝子制御ネットワークの再構築が可能になります。MULTI-seqを使用することで、初期調査のコストを低く抑え、シングルセルRNA-seqとシングルセルATAC-seqのペアサンプルを固定することで、遺伝子制御ネットワークの時間経過解析が可能になります。
研究者はこのプロトコルを利用して、発生と疾患の進行を制御する遺伝子ネットワークを理解できます。まず、各サンプルに20マイクロリットルのアンカーバーコード溶液を加え、ピペットで混ぜます。氷上で5分間インキュベートします。
次に、各サンプルに20マイクロリットルのコアンカー溶液を加え、氷上でさらに5分間インキュベートします。各サンプルに1ミリリットルの氷冷1%BSAおよびPBSを加え、細胞を300 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。
次に、400マイクロリットルの氷冷1%BSAとPBSを追加します。300 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。血球計算盤を使用して各サンプルの細胞濃度を決定し、ゲルビーズインエマルジョンまたはGEMに必要な細胞の総数と体積を計算します。
各サンプルから計算された容量を新しい滅菌1.5ミリリットルチューブに組み合わせ、組み合わせたサンプルの最終細胞濃度を決定します。GEMの生成とバーコード化の後、サイズ選択を使用して遺伝子発現cDNAクリーンアップを実行し、サンプルバーコードを含む最初の選択ラウンドの上清を廃棄しないようにします。上清を新しい滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、氷上に保管します。
常磁性ビーズベースのサイズ選択試薬をボルテックスし、260マイクロリットルの試薬と180マイクロリットルの100%イソプロパノールを上清に加えます。混合物を10回ピペットし、室温で5分間インキュベートする。チューブを磁気ラックに置き、溶液がクリアするのを待ちます。
溶液が透明になったら、上清を取り除いて廃棄します。500マイクロリットルの80%エタノールをビーズに30秒間加え、上清を捨てます。これを合計2回の洗浄で繰り返します。
ビーズを短時間遠心分離し、磁気ラックに戻します。タイマーを 2 分に設定します。次に、P10ピペットで残留エタノールを取り除き、残りの2分間磁気ラック上のビーズを風乾します。
磁気ラックからビーズを取り出し、100マイクロリットルの溶出バッファーに再懸濁します。ピペットで十分に再懸濁し、室温で2分間インキュベートした後、ビーズを磁気ラックに戻し、溶液が透明になるのを待ちます。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
示されているように、半分の量の溶出バッファーを使用してクリーンアップを繰り返します。scATACシーケンス用のサンプルについては、P200ピペットを使用してマイクロ遠心チューブから液体を取り除き、エタノールドライアイスでサンプルをフラッシュフリーズします。scRNAシーケンシング用のサンプル中の細胞を解離するには、テキスト原稿に記載されているように、パパインを使用して解離ステップを実行します。
細胞を300 x gで室温で3分間遠心分離し、細胞ペレットを破砕することなく上清を除去した。1ミリリットルの冷やしたPBSを加え、10回または細胞が完全に懸濁するまで混合します。再度、摂氏4度で300 x gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄を2回繰り返します。
最低速度設定でチューブのボルテックスを開始し、900マイクロリットルのチルドメタノールを一滴ずつ加えながら、チューブを穏やかにボルテックスして細胞の凝集を防ぎます。細胞を氷上で15分間インキュベートします。血球計算盤を用いて固定細胞の濃度を測定し、トリパンブルーを用いて固定工程の有効性を評価した。
凍結組織と固定細胞は摂氏マイナス80度で保管してください。マルチシーケンスバーコードは、複数のサンプルの複合シーケンシングとそれに続く計算デコンボリューションを可能にします。原点のサンプルは、バーコード表現に基づいて各セルについて決定することができる。
これらの組み合わせたサンプルは、細胞クラスタリングと細胞タイプの同定の目的で単一のデータセットとして分析できます。各細胞はGEM生成前にバーコード化されているため、細胞ダブレットは複数のMULTIシーケンスバーコードの発現を示す確率が高く、クラスタリングおよび細胞タイプの同定の前にダブレットの大部分を識別および除去できます。シングルセルATACシーケンシングを使用して、シングルセルRNAシーケンシングで見つかった細胞タイプと一致する細胞タイプのデータセットを生成できます。
シングルセルRNAシーケンシング遺伝子発現とシングルセルATACシーケンシングDNAアクセシビリティ情報を組み合わせることで、遺伝子制御ネットワークの再構築が可能になります。プロトコルを試みるときは、エスノール蒸発の2分間のタイミングが、後続の溶出ステップでのシーケンス検索にとって重要であることに注意してください。ペアのシングルセルRNA-seqとシングルセルATAC-seqを使用して遺伝子制御ネットワークを再構築すると、遺伝子過剰発現およびノックアウト研究のターゲットが作成されます。
この段階でMULTI-seqを使用して、細胞型特異的効果を同定することができます。
