Dieses Protokoll kann die Expansion funktioneller, nicht erschöpfender, gedächtnisähnlicher NK-Zellen ex vivo im Vergleich zu anderen Feederzellen, die auf einem Expansionssystem basieren, signifikant verbessern. Dies ist eine einfachere Methode im Vergleich zu anderen Protokollen mit Feederzellen, bei denen wir den NK-Zellisolierungsschritt vor der NK-Zellexpansion überspringen. Dieses Protokoll kann eine ausreichende Anzahl der NK-Zelle und CAR-NK für die Immuntherapie bereitstellen.
Diese Technik ist sehr reproduzierbar. Entscheidend ist jedoch, frische, neue Ausgangsstoffe zu verwenden und darauf zu achten, die NK-Zellen in den ersten Tagen der Expansion nicht zu stören. Beginnen Sie mit der Identifizierung und Sektion der lebensfähigen Gewebebereiche mit sterilen chirurgischen Geräten, um Lymphozyten zu erhalten.
Dann legen Sie die geschnittenen Gewebe in 30 Milliliter HBSS ohne Kalzium oder Magnesium und halten Sie das Gewebe auf Eis, bis es für die Isolierung bereit ist. Arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank, zerkleinern Sie das Gewebe in weniger als 0,5 Zentimeter große Würfel mit sterilen Rasierklingen und Pinzetten. Legen Sie die gehackten Gewebestücke, nicht mehr als 4 Gramm, in die Gewebedissoziatorröhrchen und fügen Sie 10 Milliliter Kollagenase IV zu den Gewebestücken hinzu.
Um das Gewebe gründlich zu zerkleinern, behandeln Sie die Gewebedissoziatorröhrchen bei 37 Grad Celsius in einen Gewebedissoziator. Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Gewebedissoziator entfernt haben, trituieren Sie das gehackte Gewebe durch ein 40-Mikron-Nylonzellsieb mit dem Backend einer 5-Milliliter-Spritze. Verwerfen Sie die großen unverdauten Fragmente.
Drehen Sie den gesammelten Eluenten bei 400G für 5 Minuten bei Raumtemperatur herunter und saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie die Zellpellets in 30% Polyvinylpyrrolidon-beschichteter Kieselsäure resuspendieren, um die Fettzellen zu entfernen. Spinn Sie die Zellen wie beschrieben herunter, bevor Sie das Zellpellet in 9 Milliliter R-10-Medien resuspendieren. Um Lymphozyten von roten Blutkörperchen und polymorphkernigen Zellen zu trennen, schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig über 4 Milliliter Ficoll- oder Lymphozyten-Trennmedien.
Trennen Sie die Schichten durch Zentrifugieren bei 400G für 23 Minuten bei Raumtemperatur bei ausgeschalteter Beschleunigung und Bremsen. Dekantieren Sie dann vorsichtig die obere mittlere Schicht und ernten Sie die Interphase, die gewebeinfiltrierende Lymphozyten enthält. Spülen Sie die Zellen mit 10 Milliliter Medien und fahren Sie mit der Analyse oder dem primären natürlichen Killer oder NK-Zellexpansionsprotokoll fort.
Waschen Sie die peripheren mononukleären Blutzellen oder PBMCs und 100 gammabestrahlte 221-mIL-21-Zellen separat durch Zentrifugation bei 400G für 5 Minuten mit 10 Milliliter R-10-Medien. Speichern Sie nach der Zentrifugation 1 x 10 bis zur 6. PBMCs für die Durchflusszytometrie und mischen Sie 5 x 10 bis zur 6. PBMCs mit 10 x 10 bis 6. 100 gammabestrahlten 221-mIL-21-Zellen in einer speziellen 6-Well-Platte. Fügen Sie 30 Milliliter R-10-Medien, ergänzt mit humanem Interleukin-2 und humanem Interleukin-15, in dieselbe 6-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, wobei die Medien alle 3 bis 4 Tage ausgetauscht werden.
Zeichnen Sie während der Inkubation den gesamten natürlichen Killer des peripheren Blutes oder PBNK, die Zellzahllebensfähigkeit auf und führen Sie alle 3 bis 4 Tage eine Durchflusszytometrie durch, um die NK-Zellexpansionsrate zu berechnen. Fügen Sie 1,8 x 10 zu den 6. 293T-Zellen in 11 Milliliter des D-10-Mediums pro behandelter 100-Millimeter-Platte hinzu und inkubieren Sie 293T-Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. In einem 1,70-Milliliter-Röhrchen 470 Mikroliter des reduzierten Serummediums mit 30 Mikrolitern des Transfektionsreagenzes mischen.
In einem separaten 1,70-Milliliter-Röhrchen werden 2,5 Mikrogramm pRDF-Plasmid, 3,75 Mikrogramm Pegpam3-Plasmid und 2,5 Mikrogramm CAR-Konstrukt in SFG-Vektor in das reduzierte Serummedium gegeben, um das endgültige Volumen von 500 Mikrolitern zu erhalten. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens mit dem zuvor vorbereiteten 1,70-Milliliter-Röhrchen tropfenweise. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur 1 Milliliter der Mischung aus dem Röhrchen tropfenweise auf die 293T-Zellplatte geben und die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden platzieren.
Verdünnen Sie das Retronektinprotein mit PBS auf eine Endkonzentration von 50 bis 100 Mikrogramm pro Milliliter. Fügen Sie 500 Mikroliter des verdünnten Retronektins in jede Vertiefung einer unbehandelten 24-Well-Platte hinzu. Dann verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Retronektinplatte bei 2, 103G für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand. Nachdem Sie jede Vertiefung der 24-Well-Platte mit 1 Milliliter R-10-Medium blockiert haben, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 1 Stunde. Filtern Sie die zuvor transfizierten 293T-Zellen mit einem 0,45-Mikron-Filter, um den Retrovirus-Überstand zu sammeln.
Aliquot 2 Milliliter des gefilterten Retrovirusüberstands in jede Vertiefung der 24-Well-Retronektinplatte. Zentrifugieren Sie die 24-Well-Retronektinplatte bei 2, 103G für 2 Stunden in eine vorgewärmte Zentrifuge bei 32 Grad Celsius. Während die Platten zentrifugiert werden, sammeln Sie die expandierten PBNK-Zellen von Tag 0 und zählen Sie die Zellen mit Trypan Blue.
Die expandierten PBNK-Zellen werden mit R-10-Medien, ergänzt mit Interleukin-2 und Interleukin-15, auf die Konzentration von 2,5 x 10 auf die 5. bis 5 x 10 bis 5. Zellen pro Milliliter verdünnt. Nach dem Zentrifugieren der 24-Well-Retronektinplatte den Retrovirusüberstand aus jeder Vertiefung teilweise absaugen. Dann fügen Sie 2 Milliliter der verdünnten expandierten PBNK-Zellen zu jeder Vertiefung hinzu.
Zentrifugieren Sie die Platte bei 600G für 10 Minuten bei 32 Grad Celsius, bevor Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden inkubieren. Übertragen Sie die Zellen von der 24-Well-Platte in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um das Röhrchen bei 400 G für 5 Minuten zu zentrifugieren. Nach dem Resuspendieren des Pellets mit 1 Milliliter R-10-Medium werden die resuspendierten Zellen in eine spezielle 6-Well-Platte überführt, die 30 Milliliter R-10-Medien enthält, die mit Interleukin-2 und Interleukin-15 ergänzt sind.
Inkubieren Sie die spezielle 6-Well-Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit erfrischenden Medien und berechnen Sie die NK-Zellexpansionsrate alle 3 bis 4 Tage. Es wurde gezeigt, dass sich die um 221-mIL-21 expandierten PBNK-Zellen fast 5 x 10 bis zur 4. Falte ausdehnten. Und die NK-Zellreinheit wurde während der 21-tägigen Expansion bei rund 85% gehalten.
Vor der Expansion wurde die Robustheit des 221-mIL-21-Expansionssystems untersucht, indem PBMCs für Anti-CD56 und Anti-CD3 gefärbt wurden, die eine Zellreinheit von 7,09% für NK-Zellen und einen hohen Prozentsatz an T-Zellen zeigten. An Tag 4 der PBMCs und der 221-mIL-21-Kokultur wurde die NK-Reinheit vor der CAR-NK-Transduktion überprüft. Die CAR-NK-Zellen, die für Anti-CD56, Anti-CD3 und Anti-Human-IgG gefärbt wurden, zeigten an Tag 7 eine hohe NK-Zellpopulation und eine hohe CAR-Transduktionseffizienz von etwa 70% wurde beobachtet.
Am 18. Tag wurde der CAR-Ausdruck in verschiedenen Teilmengen mit Durchflusszytometrie überprüft. Nach der NK-Zellexpansion können Zellen für In-vitro-Funktionstests oder für In-vivo-Experimente verwendet werden. Forscher können dieses Protokoll verwenden, um NK und CAR-NK für Patienten mit funktionellem NK-Mangel sowie andere Arten wie Hund zu erweitern.
