PAC ist teilweise durch eine NIH T32 Stipendium University of Wisconsin Stem Cell Training Program (PA Clark) unterstützt. JSK wurde teilweise durch die HEADRUSH Brain Tumor Forschungsprofessur, Roger Loff Memorial GBM Research Fund und der UW Foundation / Neurochirurgie Brain Tumor Research and Education Fund unterstützt. JCW und YH sind teilweise durch NIH NIBIB 1R01EB009103-01 unterstützt.

Ein. BTSC die Zelldissoziationslösung BTSCs sind aus bereits bestehenden Kulturen in serumfreiem Medium als Stammzelle Neurospheres gezüchtet abgeleitet. Kultur von denen bisher 10, 11 beschrieben. <ol><li> Bereiten Zellsuspension aus BTSC-derived Neurosphären. BTSC-derived Neurospheres werden in einem 15 ml konischen Röhrchen gesammelt und zentrifugiert bei 900 UpM für 5 Minuten. Schnellere Zentrifugation Scher-und / oder Schäden an der Neurosphären. Überstand wird abgesaugt und Neurosphäre Kultur wird in 0,5 ml vorgewärmtes Accutase resuspendiert. Diese Lösung wird für 5-10 Minuten bei 37 ° C ermöglicht die Neurospheres zu lockern. Zellen werden mechanisch mit 10-20 sanften Schlägen eines P100 Pipette und dann 1,5 ml Stammzelle Medium zu den Zellen hinzugefügt, um die Accutase neutralisieren gestört. </li><li> Die BTSCs werden dann bei 1300 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, gewaschen und in 1 ml Medium Stammzelle. </li><li> Eine 50 ul-Aliquot wird von den suspens entferntIon und in ein Mikrozentrifugenröhrchen platziert zur Zellzählung. 50 ul Trypanblau ist mit der Eppendorf-Röhrchen gegeben und die Suspension wird in einem Hämozytometer zur Zellzählung platziert. </li><li> Wenn nach Zellzählung benötigt wird zusätzliches Stammzelle Medium zu der BTSC Suspension auf eine Zelldichte von 20.000 lebenden Zellen / ul Medium zu ergeben. </li></ol> 2. Herstellung von zweischichtigen su-8 Master und Formen von PDMS-Stempel (siehe Abbildung 1) Wir nutzen die optische Lithographie und weiche Lithographie su-8 Master-und PDMS-Stempel, die wesentlich für die Montage der Mikrofluidik-Geräte sind zu fabrizieren. Etwas anders als die Standard-Verfahren 12, ist unser su-8 Master aus zwei Schichten. Die 3-um-tall Mikrokanäle in der ersten / unteren Schicht früher im Prozess gegossen, während die 250-um-tall Säen und Aufnahmekammern in der zweiten / oberen Schicht sind. Um für die richtige Verbindung zwischen zwei Kultur Fächer (Mikrokanals und Kammern), haben die beiden Schichten, um genau in Position ausgerichtet werden. Allerdings sind Dicke und Deckkraft der zweiten Schicht groß genug, um die fiducial / optische Ausrichter der Zugriff auf einen der unten stehenden Funktionen zu blockieren. Hier gestalten wir die Masken mit Bezugsmarken der Ferne positioniert. Somit können diese Marker in der ersten Schicht selektiv abgeschirmt werden beim Spinnen der zweiten Schicht. Als Ergebnis werden beide Schichten von Merkmalen in einem Master hergestellt und bereit zum Formen in Basrelief der PDMS-Stempel. <ol><li> Design und bereiten zwei Photomasken. Eine Maske besteht aus zwei Bezugsmarkierungen und einer Anordnung von Mikrokanälen (400 um Länge und 10 bis 50 um Breite) für die erste Schicht. Eine weitere Maske aus Setzen und Aufnahmekammern (2 mm lang und 600 um Breite) für die zweite Schicht. Beide Masken in Illustrator (Adobe, Kalifornien) sind so konzipiert, auf Transparentfolien (Thin Metal Parts, Colorado), mit Isopropanol und luftgetrocknet gereinigt Laserdruck. </li><li> Sprechen Sie die erste Schicht mitSU-8 Fotolack (MicroChem, Massachusetts) je nach Produkt-Handbuch von Lieferanten. Erstens Spin-Beschichtung der Handhabungswafer (WRS Materialien, Kalifornien) mit 3-Mikrometer dicke Photolack SU-8 (5), durch weiche Einbrennen gefolgt. Der Fotolack wird dann UV-belichtet und gehärtet mit der entsprechenden Maske in engem Kontakt, durch Einbrennen und Entwicklung verfolgt. </li><li> Spin-Beschichtung der zweiten Schicht mit 250 um dicken SU-8 (2100). Um dicke Photoresist von Blockierung der Bezugsmarken von der ersten Schicht zu verhindern, decken wir diese Bereiche mit Tesafilm in vor Spin-Beschichtung der zweiten Schicht. Das Band wird dann um die Markierungen für die Ausrichtung Zweck offenbaren geschält. </li><li> UV-Setzen der zweiten Schicht mit der zweiten Maske. Wobei die Ausrichtmarkierungen offenbart, ist es einfach, sie zu den in der zweiten Maske unter Verwendung von optischen Maskaligner auszurichten. Die zweite Schicht aus Fotolack wird dann UV-belichtet und gehärtet in enger berührungsfrei, gefolgt von Nachbrennen und Entwicklungsländer. &lt;/ Li&gt; <li> Anti-Stick-Beschichtung der Folge Meister. Zur Entfernung von ausgehärteten PDMS zu unterstützen, kann die SU-8-Master über Gasphasenabscheidung um der Oberfläche eine Antihaft-Typ Beschichtung silanisiert sein. Einfach in einen Exsikkator für mindestens eine Stunde, mit einigen Tropfen Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan Lösung unter Vakuum. </li><li> Mold PDMS mit dem Master. Mix Prepolymer Basis und Heiler der PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) in Verhältnis 10:1 gründlich. Legen Sie sie in einem Exsikkator Vakuumentgasung, bis keine Luftblasen zu sehen ist. Die Mischung auf der Maske und entgast wieder, wenn neues Luftblase eingeführt wird. Aushärten der Form auf einer Ebene Kochplatte für 2 Stunden bei 90 C. Nach dem es auf Raumtemperatur abgekühlt, vorsichtig loslassen PDMS-Stempel. So werden Kultivierung Kanäle in PDMS graviert und fertig für die Montage des Geräts. Der Master ist wiederverwendbar für Formgebung, bis er geknackt wird oder abgenutzt. Die Antihaft-Beschichtung muss erneut durchgeführt werden, wenn die Klebrigkeit gewinnt. </li></ol> 3.Montage von Mikrofluidikvorrichtungen und Zellkultivierungsraum (Abbildung 2) Um Zellkulturen ist feature-gravierten PDMS-Stempel mit einem Deckglas an geschlossene Kanäle bilden. Ein-und Auslässe für das Laden der Kultur / Medien geschaffen. Unterdessen sind Bereinigung und andere Verfahren, um das Glassubstrat und PDMS-Stempel notwendig, um die Zelle-Kompatibilität zu gewährleisten. <ol><li> Machen Reservoirs durch die PDMS-Stempel mit Biopsie Locher. Wir wählen ihr Durchmesser bis 6 mm betragen. Diese Behälter dienen zwei Zwecken. Eine besteht darin, zusätzliche Nährstoffe für das Zellwachstum zu halten. Der andere ist für den Zugang der Pipette Be-und Vakuum-Aspiration. </li><li> Weichen Sie die PDMS-Stempel in 70% Ethanol für 30 min und dann spülen Sie ihn mit de-ionisiertem Wasser für weitere 10 min. Der Zweck besteht darin, mögliche organische Reste während der Herstellung eingebracht, und unvernetzten PDMS Kontamination zu löschen. Weitere intensive und gründliche Reinigung Prozesse wie organische Extraktion 13 </sup&gt; Und Soxhlet-Extraktion 14 wurden an anderer Stelle verwendet werden. Allerdings fanden wir es unnötig in BTSC Kultur. </li><li> Sterilisieren PDMS-Stempel mit Autoklaven (121 ° C, 35 min). Dieser Schritt weiter vervollständigt die Vernetzung Reaktion PDMS. Ausgehend von diesem Schritt und bis Schritt 3,6, alle Verfahren werden in sterile Weise berücksichtigt. </li><li> Die PDMS-Stempel wird dann auf einem Deckglas, die zuvor mit Poly-L-Lysin beschichtet ist festgelegt. 15-17 Die Vorrichtung wird dann mit Laminin durch Füllen des Kanals mit Laminin Lösung über Nacht bei 37 ° C beschichtet Laminin aus der Vorrichtung abgesaugt und die Vorrichtung mit Stammzelle Medium gewaschen. </li><li> Legen Zellsuspension aus Schritt 1 in Stauseen und Kanäle. 11 ul von dissoziierten Zellen werden in einem Aussaat Reservoirs platziert. Vakuumaspiration wird verwendet, um Zellen in die Kammer zu zwingen Aussaat, wenn notwendig. Eine zusätzliche 7 ul Zellen werden die angrenzenden Aussaat Reservoirs platziert. Hinweis: Durchschnittliche Zelldichte beträgt 20.000 Zellen / ul Medien. Achterner fünf Minuten, die Aussaat und Empfangen Reservoirs sind mit den Medien überflutet. </li><li> Legen Sie ein 0,5-1 mm vor autoklaviert PDMS Blatt auf. Der natürlich aufgetreten Oberflächenhaftung zwischen zwei PDMS Stück wird die Zellkultur dicht und bereit für den Transport, die Inkubation und mikroskopische Bildgebung. </li></ol> 4. Langfristige Zeitraffer-Aufnahmen des BTSC Migration mit BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, USA). Die Kombination Kamera, Software und Gründerzentrum alles in einer Box macht diese mikroskopische System ist es möglich, Bild Zellkultur ohne Störung für Tag. Darüber hinaus bewegt sich die einzigartige Motorkonstruktion die Objektivlinse und hält Probentisch stationär in der Punkt-zu besuchen Funktion. Dies macht es praktisch, Bild parallelen Experimenten und Track Zellbewegung in Hochdurchsatz-Assay. <ol><li> Pre-Gleichgewicht der Biostation IM für 45 Minuten, um die Temperatur, Feuchtigkeit und Luftzufuhr zu stabilisieren. Zusatz von mehreren Wasser-contained Gerichte in der Probenkammer wird verwendet, um richtige Luftfeuchtigkeit zu halten. </li><li> Legen Sie die Zelle geschlossenes Gerät in den Probenraum des Mikroskops, und in der Mitte ist mit Mikro Pinzette. </li><li> Stellen Sie den Fokus, Position-Punkte und Zeit-Punkte Biostation Software und starten Sie den Zeitraffer. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für visuelle Inspektion und Charakterisierung von Krebs Zellmigration durch Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung Abschottung sind in Abbildung 3 und 4 dargestellt. Die Zell-Linie ist BTSC. Mit unserem aktuellen Setup können Phasenbilder der Zellkultur kontinuierlich so lange wie 5 Tage (Abbildung 3) und so häufig wie alle 2 Sekunden (Abbildung 4) aufgezeichnet werden. Beyond 5 Tagen, müssen Kulturmedien für Nährstoff-Nachschub und Abfall entfernt ersetzt werden. Unser langfristiges Zeitraffer identifiziert eine revolvierende Sequenz von sechs Zellstadien während ihrer Migration auf die morphologischen Veränderungen. Wie Abb.trierte in Abbildung 3, beschreiben wir sie als (i) vor der Migration, (ii) die Einleitung, (iii) Pfad-Exploration, (iv) Kreuzfahrt, (v) destination-exloration und (vi) nach der Migration. In der Aufnahmekammer, bleiben spindelförmigen Zellen in Stufe (i) wie in bulk Tumoren, die wachsen können, dividieren und schrittweise Migration sind. Als sie den Mikrokanal Eingang nähern, gehen Sie ein paar Zellen zu inszenieren (ii), wenn sie sich ausdehnen und erzeugen Kleber Vorsprung. Nur einer von ihnen ist in der Lage, um den Eingang zu besetzen und gehen zu Stufe (iii), das die Migrationsrichtung erkunden. Sobald die Zelle bestimmt die Migrationsrichtung, geht er weiter zu Schritt (iv) zu kreuzen durch den Mikrokanal in einer stetigen und hoher Geschwindigkeit, die durch die gesamte Mikrokanal ausgeführt wird. Am Ende des Mikrokanals, Zelle geht zu Stufe (v), um den offenen Raum der Aufnahmekammer zu erforschen, und dann die Stufe (vi). In Mikrokanal migriert Strom überwiegend von blebbing Aktivität wie in 4 dargestellt erzeugt, ähnlich der amöboiden cell. Zelle blebbing und Membranverformung sind voll hier erfasst. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von mikrofluidischen Gerät. Der gesamte Prozess wird auf einem 3-Zoll-Silizium-Wafer durch eine modifizierte Technik der weichen Lithographie durchgeführt. 3-um-tall Mikrokanäle und Ausrichtmarken sind wie in der ersten Schicht enthält. Dann wurden 250 um dicke su-8 aufgeschleudert, während die Ausrichtmarkierungen mit Tesafilm bedeckt sind, so dass sie später zugänglich sein Aligners ohne Sicht-Blockierung durch dicke Photoresist maskieren. Somit kann Kammer bietet als die zweite Schicht hergestellt werden und exakt an der ersten Schicht ausgerichtet sind. PDMS-Stempel wird schließlich aus dem resultierenden Master geformt. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Schematics des Gerätes Montage und Zellaussaat Prozess. Umgeben von PDMS und glass Deckplättchen wird das 3D Raum Kultivieren von Kammern, Sammelbehälter und Mikrokanälen besteht. Die Aussaat Kammer mit Zellkultur gefüllt, während die Aufnahmekammer anfänglich mit zellfreien Medien befüllt. Die Mikrokanäle, die zwischen ihnen herstellen bieten Zell Migration Weg von Aussaat Seite zu empfangenden Seite. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. BTSC Migration durch Mikrokanal. Obermaterial: Schnappschüsse von Zeitraffer zeigen eine einzelne Zelle (grün markiert) wandert über 400 um von der Aussaat Seite der empfangenden Seite. Die gesamte Fahrt dauert etwa 2 Tage, an denen eine Sequenz von Zellen morphologische Veränderungen. Der Maßstab beträgt 40 um. Untere: eine Karikatur Darstellung der sechs Migration Stufen. Vor-Migrations (i): In Seeder Kammer Spindelform zerteilbaren Zellen allmählich aneinander entlang zu wandern. Die Zellen in der Nähe Mikrokanal Eingang Rennen miteinander durch polarisierende Zellkörper und E<html> xerting Lamellipodien Vorsprung. Initiation (ii): Der wandernde Zelle mit der höchsten Kapazität belegt den Kanal Eingang, während ihre Wettbewerber zurückziehen. Path-Exploration (iii): Die wandernde Zelle Änderungen an einem amoeboid-Modus mit wenig Polarität. Diese Migration Modus ist sehr beweglich und in der Lage, Pfad in alle Richtungen zu erforschen, indem blebbing kleinen Membranausstülpungen. Cruising (iv): Sobald das Migrationspfad bestimmt wird, wandelt die Zelle in eine angepasste amöboiden Modus durch Aufrechterhalten eines zusätzlichen großen Vorsprungs Position nach vorne. Auf diese Weise hält Zelle eine hohe Beweglichkeit sowie eine feste Richtung und Geschwindigkeit. Destination-Exploration (v): Nach Weg-End, verlangsamt sich die Zelle nach unten und entwickelt filopodias den Aufnahmeraum für eine Invasion Ziel zu erkunden. Post-Migration (vi): Nach Eingabe der Aufnahmeraum, dreht Zelle in sternförmige und behält eine hohe Beweglichkeit, aber keine bestimmte Richtung. &quot;/&gt; . Abbildung 4 Snapshots der Zeitraffer zeigen den Zyklus der blebbing Aktivität und Membranverformung einer BTSC: (AB). Initiierung; (BD). Expansion; (DF). Rückzug. Die Pfeile und Kurven-Linien repräsentieren die Richtung und Lage der Membranverformung sind. Die Snapshots werden alle 8 Sekunden gesammelt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Mikrofluidik-Vorrichtung und Bild-Aufnahme hier vorgestellte Technik ermöglicht eine visuelle Charakterisierung der zellulären Morphologie während der Migration. Im Vergleich zu bestehenden herkömmlichen Methoden bietet das mikrofluidischen Plattform Vorteile der Wirtschaftlichkeit, hohen Durchsatz und Flexibilität beim Design. Das vorgestellte mikroskopische Visualisierung erlaubt Studie und Aufzeichnung von langfristigen Live Zellmigration. Das Objektiv motorisierten Funktion macht es möglich, mehrere Migrationspfade in einer hohen Bild-Auflösung verfolgen, ohne die Probe. Während der Montage der Vorrichtung ist der PDMS-Stempel nicht permanent mit dem Deckglas für die Bequemlichkeit der PDL Beschichtung (Schritt 3,4) verklebt ist. Es ist kritisch, um eine gute Abdichtung für den Erfolg dieses Protokoll zu erzielen. Verunreinigungen aus der Herstellung der Vorrichtung, wie Luftblase im Stempel oder Staub / Abfall auf dem Substrat, eingebracht werden gefährden die Verklebung und ergeben Fluid leckt. Daher TREATIng das Gerät in einem staubfrei ist wichtig, Ausfall des Gerätes zu verhindern. Vor der PDL-Beschichtung, die Deckgläschen Salpetersäure behandelt und die PDL-Lösung wird zentrifugiert, um Staub / Abfall zu beseitigen. Wir finden Tesafilm, Alkohol zu spülen und Wasserbad sehr hilfreich bei der Entfernung von Staub / Schmutz von der PDMS-Stempel, wenn ein Reinraum nicht zugänglich ist. Nachdem der PDMS-Stempel in Kontakt mit dem Deckglas, Gewindebohren den Stempel vorsichtig mit einer Pinzette erleichtert die Abdichtung. BTSCs kann aus menschlichem OP Proben über Sphäre Kultur in Stammzellen Medium, ähnlich wie Kultur von normalen neuralen Stammzellen 10 angereichert werden. BTSCs so angereicherte demonstrieren Stammzell-ähnlichen Eigenschaften, wie die Expression von Stammzellmarkern (CD133, Nestin), um mehrere neuronale Differenzierung Abstammungslinien (Glia und neuronaler) und Tumorinitiation in einem orthotopischen immundefizienten Maus-Modell mit so wenig wie 100 Zellen 18. Obwohl einige Diskussionen gibt es über AufreinigungKation und Wartung von BTSCs 1, 19-21, Kugel-grown BTSCs besser pflegen den Phänotyp und Genotyp der elterlichen Tumor 22-24. Die unterteilte Raum imitiert die physiologische Umgebung für die Zellwanderung. In unserem Gerät weisen BTSC eine starke Leistung von Migration durch ein size-constrained Raum durch Regulierung zellulärer Morphologie. Unsere Charakterisierung der Zellen morphologische Veränderungen zeigt mode-Transformationen in einer sechsstufigen Sequenz, die eine mögliche neue detaillierte Beschreibung der BTSC Invasion von benachbarten Gehirns modellieren können. In frühen Stadien, gewinnen die Zellen eine erhebliche Menge an Polarität und erzeugen Klebstoff Vorsprünge wirksam verankern sich innerhalb des Mikrokanals. Sobald die Zelle Belegung im Mikrokanal hergestellt wird, wandelt es in ein Cruising-Modus und hält diesen Modus für die gesamte Fahrtstrecke durch einen Mikrokanal. Zu diesem Zeitpunkt halten BTSC hoher Beweglichkeit und konsistente Richtung, sondern Energie zu sparen. InInteressanterweise scheint es, dass eine Mikrokanal einem Cruising-Zelle wird zu einem Zeitpunkt begrenzt, so dass, wenn eine einzige Zelle geht zu diesem Zeitpunkt anderen Zellen Rückzug aus dem Mikrokanal. Dieser Mechanismus dürfte gewährleistet Wirksamkeit der Tumorausbreitung und verhindert Mehrverbrauch von Nährstoffen in Mikrokanal. Nach Abschluss der Migration auf den Mikrokanal, gewinnt eine Zelle seine Neigung für multidirektionale Vorsprünge und die weitere Exploration Invasion Ziele oder neue Migrationspfade. Die Abschottung mikrofluidischen Gerät bietet eine neuartige in vitro Mittel zur Schaffung einer Mikroumgebung für das Studium BTSC Infiltration von Hirnparenchym. Diese Methode kann leicht auf die Untersuchung von Krebsstammzellen (CSC) und wandernde Zelllinien aus anderen Tumorarten abgeleitet angepasst werden. Kultivieren von Zellen in der mikrofluidischen Vorrichtung kann in jeder modernen Biologie Labor, mit einem Inkubator und Gewebekultur Fachwissen ausgestattet ist durchgeführt werden. Ausgestattet mit einem SU-8 Master PDMSGieß-und Gerätemontage sind möglich mit einigen grundlegenden Ausbildung in Softlithographie. Darüber hinaus kann diese Plattform auch für andere Anwendungen mit integrierender andere funktionelle Module wie Gradientenmischer, Oberflächenstrukturierung, Fluidsteuerung und Mikroelektrode verlängert werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), hohe Glucose </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> Ham-F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> B27 Ergänzung minus Vitamin A </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> Antibiotikum-Antimykotisches (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor (EGF), rekombinanten humanen </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), rekombinanten humanen </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> Heparin-Natrium-Salz, Darmschleimhaut von Schweinen </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> Laminin (natürliche Maus) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Hirntumor Stammzellen (BTSC) Kultur Lieferungen </td></tr><tr><td> Stammzell-Medium </td><td></td><td></td><td><ul><li> 30% Hams F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> 1% Antibiotika-Antimykotika </li><li> 2% B27 ohne Vitamin A </li><li> EGF (20 ng / ml) und bFGF / Heparin (20 ng/ Ml bFGF, 5 mg / ml Heparin) Mix Zutaten und Sterilfilter vor Gebrauch </li></ul></td></tr><tr><td> Basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) / Heparin </td><td></td><td></td><td><ul><li> Aliquot Konzentration von 20 pg / ml </li><li> Für 25 ug: In 1,25 ml 5mg/ml Heparin 25 ug bFGF. </li><li> Für 250 ug: 1 mL 5mg/ml Heparin 250 ug bFGF. Transfer zum 15 mL konischen und fügen 11,5 ml 5 mg / mL Heparin konisch. </li><li> Store als 50 ul oder 250 ul Aliquots bei -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Aliquot Konzentration von 20 pg / ml </li><li> Für 200 ug: 1 mL sterilem DMEM (Gibco 11965-118) bis 200 ug EGF. Transfer zum 15 mL konischen und 9 ml DMEM. </li><li> Für 500 ug: 1 mL sterilem DMEM (Gibco 11965-118) bis 200 ug EGF. Transfer zum 50 mL konischen und fügen Sie 24 ml DMEM. <li> Speichern, wie 50 &amp; mu, L oder 250 ul Aliquots bei -80 ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Heparin </td><td></td><td></td><td><ul><li> Aliquot Konzentration 5 mg / ml </li><li> Abwiegen 100 mg Heparin. </li><li> Je 100 mg Heparin zu 20 ml (70%) DMEM-(30%) F12-(1%) PSA (14 ml DMEM, F12 6 mL, 200 ul PSA) </li><li> Sterilfilter </li><li> Store als 50 ul oder 250 ul Aliquots bei -80 ° C </li></ul></td></tr><tr><td> SU-8 Fotolack </td><td> MicroChem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Silizium-Wafer </td><td> WRS Materialien </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) silan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> 50 ug /ml in PBS-Puffer für die Endkonzentration </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> Nikon Instrumente </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging

In den letzten 40 Jahren investierte die Vereinigten Staaten über 200 Milliarden Dollar für die Krebsforschung, was nur ein Rückgang um 5% in Todesrate. Ein großes Hindernis für die Verbesserung der Behandlungsergebnisse ist die schlechte Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Zellwanderung mit aggressiven Invasion von Krebszellen, Metastasierung und Therapieresistenz 1 zugeordnet. Glioblastoma multiforme (GBM), der häufigsten primären bösartigen Erwachsenen Gehirntumor 2, steht beispielhaft für diese Schwierigkeit. Trotz Standard-Operation, Bestrahlung und Chemotherapie, ist geduldig mediane Überlebenszeit nur 15 Monate, aufgrund der aggressiven GBM Infiltration in die benachbarten Gehirn und schnellen Rezidiv 2. Die Wechselwirkungen von aberranten Zelle wandernde Mechanismen und der Tumor-Mikroumgebung wahrscheinlich unterscheiden Krebs aus normalen Zellen 3. Daher verbessert Therapieansätze für GBM erfordern ein besseres Verständnis von Krebs Zellmigration Mechanismen. Neuere Arbeiten schlägt thata kleine Subpopulation von Zellen innerhalb GBM, kann das Gehirn Tumor Stammzellen (BTSC), verantwortlich für Therapieresistenz und Rezidiv. Mechanismen BTSC Migrationsfähigkeit sind erst am Anfang gekennzeichnet 1,4 sein. Aufgrund einer Einschränkung in der visuellen Inspektion und geometrischen Manipulation konventionellen Zellmigrationsassays 5 werden zur Quantifizierung insgesamt Zellpopulationen beschränkt. Im Gegensatz dazu ermöglichen mikrofluidischen Bauteilen einzelne Zelle Analyse wegen Kompatibilität mit modernen Mikroskopie und Kontrolle über Mikro-Umgebung 6-9. Wir stellen eine Methode zur detaillierten Charakterisierung BTSC Migration mit Abschottung mikrofluidischen Bauteilen. Diese PDMS-made-Geräte warf den Gewebekultur-Umgebung in drei zusammenhängende Fächer: Aussaat Kammer, Aufnahmeraum und Bridging Mikrokanälen. Wir maßgeschneiderte das Gerät, so dass beide Kammern ausreichende Medien halten, um tragfähige BTSC für 4-5 da unterstütztys ohne Medienbrüche Austausch. Hochmobile BTSCs zunächst in der Aussaat eingeleitet werden nach der Migration aber Bridging Mikrokanäle der parallelen Aufnahmeraum getrennt. Diese Migration simuliert Krebs zellulären Ausbreitung durch die Zwischenräume des Gehirns. Die Phase Live-Bilder der Zellmorphologie während der Migration werden über mehrere Tage aufgenommen. Weit wandernde BTSC kann daher isoliert, rekultivierten, und weiter analysiert. Abschottung Mikrofluidik eine vielseitige Plattform, um das Zugverhalten von BTSCs und andere Krebsstammzellen zu studieren. Durch die Kombination von Gradienten Generatoren, Fluid Handling, Mikro-Elektroden und anderen mikrofluidischen Modulen, können diese Geräte auch für Wirkstoff-Screening und Diagnose von Krankheiten 6 verwendet werden. Isolation eines aggressiven Subpopulation von wandernden Zellen ermöglichen Studien der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen.

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Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Eine Abschottung mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung von Krebsstammzellen Migration beschrieben. Diese neuartige Plattform schafft eine tragfähige zellulären Mikroumgebung und ermöglicht mikroskopische Visualisierung der lebenden Zelle Fortbewegung. Höchst beweglich Krebszellen isoliert sind, um molekularen Mechanismen von aggressiven Infiltration, was möglicherweise zur wirksameren zukünftige Therapien.

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison. Eine Abschottung mikrofluidischen Vorrichtung zur Untersuchung von Krebsstammzellen Migration beschrieben. Diese neuartige Plattform schafft eine tragfähige zellulären Mikroumgebung und ermöglicht mikroskopische Visualisierung der lebenden Zelle Fortbewegung. Höchst beweglich Krebszellen isoliert sind, um molekularen Mechanismen von aggressiven Infiltration, was möglicherweise zur wirksameren zukünftige Therapien.

Serie: Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

Cell Death mit Abnormal Mitose Assoziierte Beobachtet von konfokalen Imaging im Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Bereicherung für chemoresistenten Eierstockkrebs Stammzellen aus menschlichen Zelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.