Das HTX-Labor bietet Online-Zugang zu vollautomatischen Protein-zu-strukturierten Pipelines, die zur Lösung neuer Strukturen und zur Durchführung eines größeren Fragment- und Legan-Screenings eingesetzt werden können. Durch die Kombination der CrystalDirect-Technologie für die automatisierte Kristallernte und CRI-Kühlung auf der CRIM-Software, wo Wissenschaftler den gesamten Kristallographieprozess über das Internet steuern können. Öffnen Sie zunächst das Crystal Graphic Information Management System in einem Webbrowser und melden Sie sich bei diesem an, und klicken Sie auf das Menü Beispiele, um eine Schnittstelle mit dem Projekt in den Sample Management Tools zu öffnen.
Klicken Sie auf Neues Beispiel, geben Sie im Beispielfenster die angeforderten Informationen ein, und klicken Sie auf Speichern und Anforderung stellen. Wählen Sie im Anforderungsbereich das Kristallisationsprotokoll, die Inkubationstemperatur, die zu verwendenden Kristallisationssiebe und das gewünschte Datum für die Experimente aus, die mit der für den Probenversand erforderlichen Zeit kompatibel sein sollten. Verwenden Sie die Kommentarfelder, um Hinweise auf die Beispiele zu geben, die für die HDX-Laborbediener wichtig sind.
Nach der Einreichung wird die Kristallisationsanfrage vom Team des High Throughput Crystallization Lab validiert. Eine Bestätigung über die Planung des Experiments wird per E-Mail gesendet. Bei der Ankunft der Probe in der Einrichtung.
Das Laborpersonal richtet das Experiment ein, sendet eine Bestätigung des Setups per E-Mail und überträgt die Kristallisationsschalen an die automatisierten Imager. CRIMS bietet Zugriff auf alle experimentellen Parameter und verfolgt neue Bildgebungssitzungen in Echtzeit. Wenn neue Bilder verfügbar sind, werden automatisch E-Mail-Benachrichtigungen gesendet.
Um die Bilder von den Kristallisationsplatten anzuzeigen, öffnen Sie das Menü "Platten" und navigieren Sie zum Beispiel. Klicken Sie auf Ansicht, um die letzte Imaging-Sitzung anzuzeigen, oder klicken Sie auf das Expand-Symbol, um eine andere Imaging-Sitzung auszuwählen und den Drop-Verlauf zu überprüfen. So filtern Sie Beispiele für ein ausgewähltes Projekt.
Klicken Sie auf das entsprechende Projektfeld. Für die meisten Tabellenspalten stehen auch Suchfunktionen zur Verfügung. Um die Ergebnisse der Kristallisationsexperimente auszuwerten und zu bewerten, wählen Sie die Plattenansichtsschnittstelle aus und navigieren Sie durch die verschiedenen Wände der Kristallisationsplatten.
Wählen Sie den Bildtyp und wählen Sie die Bildqualität aus oder zeichnen Sie die Partituren auf. Die Ansichtsschnittstelle liefert auch alle experimentellen Parameter, die für die Kristallisationsexperimente verwendet werden, einschließlich der Zusammensetzung der Kristallisationslösung. Um Kristalloptimierungsbildschirme basierend auf den primären Trefferbedingungen zu entwerfen, die bei der ersten Überprüfung identifiziert wurden, öffnen Sie das Verfeinerungsmenü und wählen Sie das Untermenü Bildschirme.
Wählen Sie den Plattentyp, die Standardlösungen oder die Gradientenkonfigurationen aus, die am besten zum experimentellen Design passen. Es ist möglich, CRIMS zu bitten, eine Datei auszugeben, die direkt mit dem Formulierroboter formulatrix kompatibel ist, um die Siebe automatisch in die Platte zu pipettieren oder ein druckbares Dokument auszugeben, aber die Bände für den manuellen Betrieb. Sobald der Kristall für Röntgenbeugungsexperimente geeignet ist, navigieren Sie zum Plate View Interface und verwenden Sie die vorgespeicherten Scores, um das Bild auszuwählen, das dem richtigen Kristallisationstropfen entspricht.
Klicken Sie auf Kristallernte, um einen automatisierten Kristallernteplan vom Crystal Direct Harvester-Roboter aufzuzeichnen. CRIMS zeichnet automatisch die Position der geernteten Kristalle auf und speichert sie entweder in Spine- oder Unit-Pucks. Als nächstes werden die Bediener, dass unsere Einrichtung die Platten mit den Ernteplänen von den Imagern entfernen und an den CrystalDirect-Roboter übertragen wird.
Nach Abschluss der Kristallernte werden die Pucks mit den Proben in einen CX 100 Dewar gegeben oder in das Synchrotron Ihrer Wahl überführt. Um die kryogekühlten Proben zu untersuchen, öffnen Sie das Menü "Kristall-Manager" und wählen Sie "Geerntete Kristalle". Die Bilder des Ernteprozesses, einschließlich der Bilder der Pins mit den geernteten Kristallen, werden dort verfügbar sein.
Um Probensendungen für die Röntgenbeugungsanalyse zu erstellen, öffnen Sie das Menü Sendungen und klicken Sie auf Sendung erstellen, um das gewünschte Synchrotron und die Beutelnummer auszuwählen. Kommentare zur Unterstützung der Datenerfassung sowie vordefinierte Parameter für die Datenerfassung an vollautomatischen Beamlines können ebenfalls eingegeben werden. Das HDX-Labor bietet auch Zugang zu vollautomatischen großflächigen Fragment-Screenings.
CRIMS-Ressourcen zur automatisierten Datenverarbeitung und Trefferidentifikation auf Basis der globalen Phasing-Software Pipeline Pipe Dream ermöglichen es, Ergebnisse über Hunderte bis Tausende von Datensätzen in einem einzigen Projekt schnell auszuwerten und zu priorisieren. CRIMS kommuniziert mit den Synchrotron-Informationsmanagementsystemen und ruft Informationen über die eigentlichen Beugungsexperimente ab. Öffnen Sie das Crystal Manager-Menü und wählen Sie Kristallbeugungsdaten aus, um zusammenfassende Informationen und die Ergebnisse der anfänglichen Datenverarbeitung am Synchrotron anzuzeigen.
In dieser repräsentativen Analyse wurden die automatisierten Kristallographie-Pipelines wie demonstriert zur strukturellen Identifizierung verschiedener Proteine verwendet. Wie beobachtet, wurden dank der schnellen Abfolge von Kristallscreening-Optimierung und Beugungsmessungen in sehr kurzer Zeit drei verschiedene Bestätigungszustände einer Protease aus einem pathogenen Bakterium identifiziert. Diese Pipeline wurde kürzlich auch auf die Identifizierung von Fragmenten angewendet, die beide an die aktiven an mehreren Alasterstellen von Trypanosoma brucei binden.
Farnesylpyrophosphat-Synthase ist ein Schlüsselenzym des Parasiten, der die menschliche afrikanische Trypanosomiasis verursacht. Dieser Prozess minimiert die Verzögerung zwischen Kristallwachstum und Messung und beschleunigt den Fortschritt. Es befreit Wissenschaftler auch von komplexen Operationen wie Kristallhandhabung und Beamline-Betrieb, wodurch die Kristallographie für Nicht-Experten zugänglicher wird.
Dieser Ansatz kann dazu beitragen, die translationale Forschung zu fördern und dann den Prozess der Arzneimittelentdeckung zu beschleunigen. Beitrag zur Entwicklung besserer und sichererer Medikamente gegen eine größere Anzahl von Zielen.
