Das FASP-Protokoll ist ein interessanter Ansatz für Ihre Harnproteomik wegen seiner Kompatibilität mit stark denaturierenden Puffern und wegen seiner Fähigkeit, die Probe auf den Filter zu konzentrieren, was für eine verdünnte Proteinprobe entscheidend ist. Das FASP-Protokoll in Verbindung mit der datenunabhängigen Analyse-Massenspektrometrie ermöglicht es uns, eine tiefe Proteomabdeckung im EPS-Urin zu erreichen, der Urin ist, der nach einer digitalen rektalen Untersuchung gesammelt wird. Wir wenden derzeit die Methode an, die Sie in einer Biomarker-Entdeckungsaktion gegen Prostatakrebs sehen werden.
Das Verfahren wird von Licia Prestagiacomo, Paola Morelli und Caterina Gabriele gezeigt. Zentrifuge EPS-Urinproben innerhalb von zwei Stunden nach der Entnahme für 10 Minuten bei 2, 100 RCF bei Raumtemperatur. Dann lagern Sie die Überräube bei minus 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch.
Werfen Sie die Proben auf Eis, oder bei vier Grad. Um das Verfahren zu beschleunigen, können Sie die Proben von minus 80 auf minus 20 am Tag vor der Verdauung übertragen. Als Lagerlösungen benötigen Sie 500 Millimolar DTT, 10%SDS, einen molaren Tris Puffer bei pH 8.
Verdünnen Sie 500 Mikroliter jeder EPS-Urinprobe mit 67 MikroliterS SDS, 67 Mikroliter DTT und 33 Mikroliter Tris Puffer. Bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten mit sanftem Schütteln inkubieren. Montieren Sie die Zentrifugalfiltereinheit mit einem abgeschnittenen 10.000 Dalton-Molekulargewicht.
Dann 300 Mikroliter verdünnter EPS-Urinprobe in den Filter geben. Zentrifuge bei 14.000 g für ca. 20 Minuten. Sie können den Vorgang nach etwa 15 Minuten vorübergehend unterbrechen, um zu überprüfen, ob die Filtration reibungslos verläuft.
Fahren Sie fort, bis die gesamte Lösung den Filter durchlaufen hat. Dann 200 Mikroliter Harnstoffpuffer und Zentrifuge bei 14 000 g für 15 Minuten hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Schritt ein zweites Mal.
Wenn der Durchfluss den Filter berühren soll, entleeren Sie die Sammlung Eppendorf, indem Sie den Durchfluss herauspfeifen. Proteine sind auf dem Filter sicher. Für die Cystein-Alkylierung, bereiten Sie eine Iodoacetamid-Lösung unmittelbar vor der Verwendung.
Wiegen Sie etwa 10 Milligramm Iodoacetamid in einer Reihe Eppendorfer Durchstechflasche und lösen Sie sie im Harnstoffpuffer in einer Konzentration von 9,25 Milligramm pro ml oder in Molaritätsbegriffen 50 Millimolar auf. Fügen Sie 50 Mikroliter Iodoacetamid-Lösung zu jedem Filter und Zentrifuge bei 6 000 g für 25 Minuten. Die niedrigere Zentrifugationsgeschwindigkeit lässt die Filter nicht trocken laufen.
Nach der Proteinalkylierung die Filter mit zwei aufeinanderfolgenden 200 Mikroliter-Aliquots Harnstoffpuffer und Zentrifuge bei 14 000 g 20 Minuten waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss. 200 Mikroliter 50 Millimolar drei Ethylammoniumbicarbonatpuffer und Zentrifuge bei 14 000 g für 20 Minuten hinzufügen.
Wiederholen Sie diesen Schritt. Nach Vollständiger Fertigstellung der letzten Bicarbonatwäsche die Filtereinheit in ein neues Sammelrohr geben. Fügen Sie dann 60 Mikroliter 50 Millimolar TEAB Puffer hinzu.
Fügen Sie einen Mikroliter Trypsinlösung in einer Konzentration von 200 Nanogramm pro Mikroliter Trypsin hinzu. Alternativ können Sie den Verdauungspuffer für alle Proben in einer Eppendorfer Durchstechflasche vorbereiten und 61 Mikroliter des Verdauungspuffers an jeden Filter verteilen. Wenn Sie einen ThermoMixer verwenden, um Probenverdunstung während der nächtlichen Inkubation zu vermeiden, wickeln Sie jede Filtereinheit mit einer Schicht Aus Aluminiumfolie und dann mit einer Schicht Parafilm.
Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad über Nacht. Am nächsten Morgen die Filter für eine sehr kurze Drehung auf eine Tischzentrifuge übertragen. Nach dem Spinnen die Eppendorfer Deckel öffnen und 140 Mikroliter Wasser hinzufügen.
Zentrifugieren Sie die Fläschchen bei 14.000 g für 25 Minuten, um die Peptide zu sammeln. Das gesammelte Volumen sollte etwa 190 Mikroliter betragen. Um Spuren von SDS aus dem Digest zu entfernen, wird eine starke Kationenaustauschreinigung der Peptide vor LC-MS-MS empfohlen.
Bereiten Sie die Mikrosäulenhalter vor, indem Sie Eppendorf-Deckel mit einem scharfen Werkzeug wie einer Pinzette oder einer Schere durchbohren. Der Halter wird die Mikrosäule während der Zentrifugation aufnehmen. Da sie mühsam vorbereitet werden, können Halter mehrmals verwendet werden.
Entfernen Sie mit einer stumpfen und einer Nadel eine Plaque der entsprechenden Extraktionsscheibe. Extraktionsscheiben sind weiche polymere Materialien, die Sorptionspartikel enthalten. In diesem Fall besteht das Sorbens aus Partikeln mit starken Kationenaustauscheigenschaften.
Nehmen Sie die Plaque in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf. Drücken Sie den Stecker mit einem Kolben gegen Ende der Spitze. Die kleine Scheibe sollte fest geschoben werden, aber übermäßige Festigkeit zu vermeiden.
Setzen Sie die Spitze in den Halter ein und montieren Sie die Spin-Mikrosäule mit einer zwei Milliliter Eppendorf-Durchstechflasche, aus der der Originaldeckel entfernt wurde. Der Stecker aus einer Spurweite 16 Nadel hat eine Belastbarkeit von etwa fünf Mikrogramm Peptide. Konditionieren Sie die Mikrosäule mit zwei aufeinanderfolgenden Wassen.
Die entsprechende Geschwindigkeit hängt davon ab, wie stark Sie die Scheibe in die Pipettenspitze schieben. Ziel ist es, eine Durchflussmenge in der Größenordnung von 20 bis 30 Mikroliter pro Minute zu erreichen. Versuchen Sie, die Spitze beim Waschen und beim Probenladen nicht trocken laufen zu lassen.
Verdünnen Sie die Probe fünffach in Waschlösung zwei und laden Sie die Ergebnisse in Lösung mit langsamerer Geschwindigkeit. Ziel für eine Durchflussrate von etwa 15 bis 20 Mikroliter pro Minute. Verwerfen Sie ggf. den Durchfluss.
Restwaschmittel wegwaschen. Dann lassen Sie die Scheibe vor der Peptidelution trocken laufen. Die Mikrosäule in ein sauberes 1,5 Eppendorf-Rohr geben und sofort das Eluent hinzufügen.
Das sind sieben Mikroliter einer 500 Millimolaren Ammoniumacetatlösung, die 20% Acetonitril enthält. Verdünnen Sie das Eluat mit 27 Mikrolitern 0,1% Ameisensäure, um den Anteil an organischem Lösungsmittel zu senken, und injizieren Sie dann zwei Mikroliter der resultierenden Lösung in LC-MS-MS mit Detektion im datenabhängigen Modus. Details zum LC-MS-Setup, das in diesem Protokoll verwendet wird, werden später im Video angezeigt.
Nach der Datenbanksuche und Peptidfehlerintegration berechnen Sie den gesamten Spitzenbereich. Vergleichen Sie es dann mit einer externen Standardkurve, um die Peptidkonzentration im FASP-Digest zu schätzen. Nach der Schätzung der Peptidmenge, reinigen Sie eine neue Aliquot von FASP-Digest entsprechend zwei Mikrogramm Peptide durch zwei aufeinander folgende StageTip-Reinigungen, wie hier beschrieben.
Das in diesem Protokoll verwendete LC-MS-Setup basiert auf einer Direkteinspeisung in die analytische Spalte. Wenn Sie ein System mit einer Trapping-Spalte verwenden, können Sie den Schritt der Offline-C18-Reinigung vermeiden. Denken Sie daran, spezielle Nadeln und Kolben für jedes chromatographische Material zu verwenden.
Nach der Eluierung der Peptide aus der C18 Stage Tip mit 10 Mikroliter Eluent, verdampfen Sie das Eluat teilweise in einer Vakuumzentrifuge für ein paar Minuten, versuchen, eine vollständige Verdunstung zu vermeiden. Fügen Sie dann 47 Mikroliter 0,1% Ameisensäure hinzu und legen Sie die resultierende Lösung in eine HPLC-Durchstechflasche für die LC-MS-Analyse. Das hier verwendete System basiert auf der direkten Spaltenentnahme ohne Verwendung einer Trapping-Spalte.
Analytische Säulen werden intern durch Ziehen einer 75-Mikrometer-ID-Kapillare nach dem Entfernen eines Stücks Polyamidbeschichtung hergestellt. Die resultierende Spitze kann mit einem Keramikschneider schonend geformt werden. Die Kapillare wird dann in eine Packbombe gelegt und mit einer Isopropanolschlämmmenge von 50 Milligramm pro ml von C18 drei Mikrometer stationären Phasenpartikeln verpackt.
Es wird ein Gasdruck zwischen 10 und 20 bar Stickstoff oder Helium benötigt. Sie können alternative oder kommerzielle Chromatographiesäulen mit einem Submikroliter pro Minutendurchfluss verwenden. Montieren Sie die Säule auf einem T-Stück.
Die beiden anderen Enden sind an das Hochspannungsnetz teilhabenund an die HPLC-Schleife angeschlossen. Bewerten Sie die optimale Sprühspannung, indem Sie das System bei isokratischem Durchfluss betreiben. Beginnen Sie dann mit der Analyse.
Trennen Sie die Peptide über einen zweistündigen Chromatographiegradienten, wie dargestellt. Die Datenerfassung besteht aus einem schnellen vollständigen MS-Dienstscan, gefolgt von 26 MS-MS-Scans auf Vorläuferfenstern variabler Breite. Ab 20 m/z Breite, für die ersten 20 Fenster, die einen m/z Bereich von 350 bis 750 Thompson abdecken.
Wechseln Sie dann auf eine Breite von 50 m/z für die folgenden fünf Fenster und enden mit einem einzelnen MS-MS-Scan mit einer Isolationsbreite von 200 Thompson. Engere Breiten machen eine stärker besiedelte Region des Spektrums in Bezug auf das Vorhandensein von Peptid-Vorläufern aus. Für die DIA-Analyse benötigen Sie eine Spektralbibliothek.
Um eine Spektralbibliothek zu generieren, können Sie einige datenabhängige Experimente auf demselben LC-MS-MS-System durchführen, das Sie für die DIA-Erfassung mit demselben Chromatographiegradienten verwendet haben. Die Probenfraktionierung erhöht die Proteomabdeckung. Stage Tips können für die Probenfraktionion verwendet werden.
Starker Kationenaustausch und grundlegende Rückwärtsphase sind zwei gültige Alternativen. Beginnen Sie mit den 10 Mikrogramm eines Pools aus mehreren FASP-Digests. Versauern Sie die Probe mit einer Endkonzentration von 0,2% TFA.
Laden Sie die Peptide auf C18 Stage Tips mit hoher Kapazität. Verwenden Sie mehrere Discs bei hohen Peptidmengen. Für 10 Mikrogramm Material werden zwei Scheiben empfohlen.
Führen Sie die C18-Reinigung wie zuvor beschrieben durch. Bereiten Sie mehrere Fläschchen für die Eluat-Sammlung vor. So viele wie die Anzahl der Brüche.
In diesem Fall werden 10 Fraktionen durch schrittweise Elution erzeugt. Nach der letzten Wäsche 20 Mikroliter des ersten Eluenten hinzufügen. 0,2%Ammoniumhydroxid, 10 Millimolar TEAB, 4%Acetonitril.
Nachdem der erste Bruch im ersten Eppendorf vollständig verwässert wurde, verschieben Sie den Stage Tip in die nächste Sammelflasche. Verdünnen Sie in 20 Mikroliter Schritten mit als Eluent, 0,2% Ammoniumhydroxid, 10 Millimolar TEAB, und dann erhöhung der Menge an Acetonitril. Nachdem Sie die Probe fraktioniert und datenabhängige Experimente für jeden Bruch ausgeführt haben, generieren Sie Ihre Spektralbibliothek durch Datenbanksuche nach MS-MS-Daten.
Die Bibliothek wird dann in eine Software importiert, die in der Lage ist, DIA-Datenanalysen für die Proteinquantifizierung auf der Grundlage eines Minimums von einem eindeutigen Peptid zu erstellen, das durch mindestens drei Übergänge zugewiesen ist. Erwarten Sie, eine breite Palette des Harnproteoms abzudecken. Diese Abbildung zeigt die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen über einen Überflussbereich, der sich über fünf Größenordnungen erstreckt.
Der hier vorgestellte Workflow kombiniert den Konzentrationsvorteil und die Vielseitigkeit des FASP-Protokolls mit der Empfindlichkeit des DIA-Scanmodus. Diese Kombination bietet eine reiche Karte des Harnproteoms. Da unser Analyse-Setup nicht die Verwendung einer Trapping-Säule beinhaltet, wurde der FASP-Digest sowohl durch starken Kationenaustausch als auch durch umgekehrte Phasen-Stufentipps gereinigt.
Der Schritt "Umgekehrte Phase Stage Tips" kann weggelassen werden, wenn eine Trapping-Säule direkt mit der analytischen Spalte verbunden ist. Die Verwendung dieses Workflows wird für die Analyse von EPS-Urinproben empfohlen, aber seine Verwendung kann auf Harnproteomik im Allgemeinen erweitert werden.
