Hier stellen wir das Protokoll zur Verwendung von Ethanol als Lösungsmittel zur Extraktion und Charakterisierung taiwanesischer grüner Propolis vor, die die antibakterielle Aktivität hemmen. Dieses Protokoll ist eine zuverlässige und wiederholbare Methode zur Bestimmung der Qualität der taiwanesischen grünen Propolis. Demonstrierend werden Chun'Ting Chen und Yi'Hsuan Chien, Doktoranden aus meinem Labor sein.
Um zu beginnen, wiegen 100 Gramm taiwanesischen grünen Propolis. Mit einem Gewürzschleifer, mahlen Sie die Propolis sicherstellen, dass die Stücke zu einem feinen Pulver ohne große Partikel gemahlen werden. Legen Sie fünf Kolben fest und fügen Sie jeweils 100 Milliliter verschiedener Ethanolkonzentrationen in Wasser hinzu.
Mischen Sie 10 Gramm gemahlene Propolis in die Ethanol-Lösung in jedem Kolben, und inkubieren bei 25 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min für 48 Stunden. Danach verwenden Sie Filterpapier mit einer Porengröße von 25 Mikrometern, um die Ethanolextrakte zu filtern. Mit einem Volumenkolben die Filtrate auf ihr ursprüngliches Volumen von 100 Millilitern mit 95% Ethanol rekonstituieren.
Bewahren Sie die rekonstituierten Extrakte bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit sind. Wenn Sie bereit sind, die Extrakte für HPLC vorzubereiten, verwenden Sie die Vakuumverdampfung, um 10 Milliliter jedes Extrakts bei 40 Grad Celsius für 10 Minuten zu konzentrieren. Backen Sie die Trockenmasse bei 45 Grad Celsius für 24 Stunden.
Rekonstituieren Sie dann jede Probe trockener Materie mit 10 Millilitern 95%Ethanol. Mit einem Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern pro Extrakt refiltern und das Filtrat zur direkten Analyse mit HPLC sammeln. Um mit der Erstellung einer Standardkurve zu beginnen, bereiten Sie einen Liter der mobilen Phase Methanol zu Wasserlösung im Verhältnis von 88,8 zu 11,2 vor.
Mit der mobilen Phasenlösung als Lösungsmittel können Sie serielle Verdünnungen der Propolin-Standardkonzentrationen, wie im Textprotokoll beschrieben, vorbereiten. Injizieren Sie 20 Mikroliter jeder Standardkonzentration sequenziell in die Reverse-Phase-Säulen von der niedrigsten Konzentration auf die höchste. Legen Sie dann die HPLC-Säule auf 30 Grad Celsius fest, legen Sie die Verzichtslänge des UV-Detektors auf 280 Nanometer und die Durchflussrate auf einen Milliliter pro Minute und die Rekorderzeit auf 20 Minuten fest.
Analysieren Sie die Standards mindestens dreimal. Verwenden Sie anschließend die Berechnungstabellensoftware, um die Messantwort an die Konzentration zu anheften, was zu einer Standardkurve mit einer ermittelten Gleichung und einem R-Quadratwert führt. Um mit der Analyse der Extrakte zu beginnen, injizieren Sie 20 Mikroliter jedes Extrakts in die Umgekehrte Phasenspalte.
Stellen Sie die HPLC-Säule auf eine Temperatur von 30 Grad Celsius und eine Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute ein. Stellen Sie die Verzichtslänge des UV-Detektors auf 280 Nanometer und die Rekorderzeit auf 20 Minuten ein. Analysieren Sie die Extrakte mindestens dreimal.
Verwenden Sie dann die Standardkurve, um die Propolinkonzentration in jedem Ethanolextrakt zu bestimmen. Nach der Vorbereitung der Testorganismen und Ethanolextrakte 10 Mikroliter verdünnter Ethanolextrakt, die zwischen 0,156 und 640 Mikrogramm pro Milliliter in die Brunnen einer 96-Well-Platte reichen. Verwenden Sie Brühe, um die Lautstärke in jedem Brunnen auf 100 Mikroliter einzustellen, um sicherzustellen, dass 5%DMSO in allen Verdünnungen erhalten bleibt.
Als nächstes impfen Sie 100 Mikroliter Bakterienkultur in jeden Brunnen der 96 Brunnenplatte. Kultur bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Verwenden Sie einen Mikroplattenleser mit 590 Nanometern, um das Bakterienwachstum entsprechend der Trübung zu analysieren und die minimale hemmende Konzentration zu bestimmen.
Danach impfen Sie 10 Mikroliter flüssige Kultur aus jedem Brunnen, der sich auf eine Agarplatte wachsen lässt. 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Identifizieren Sie die niedrigste Konzentration, die kein sichtbares bakterielles Wachstum zeigte, um die bakterielle Aktivität zu bestimmen.
Die Konzentration, die das Zellwachstum vollständig eliminierte, gilt als die minimale bakterielle Konzentration. In dieser Studie wird taiwanesische grüne Propolis mit Ethanol extrahiert. Die Trockenmasseausbeute scheint am höchsten zu sein, wenn eine hohe Konzentration von Ethanol verwendet wird, und am niedrigsten, wenn Wasser verwendet wird.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein organisches Lösungsmittel während dieser Extraktion am besten abschneidet und dass der Ertrag positiv mit der Ethanolkonzentration in Verbindung gebracht wird. Ebenso scheint die Konzentration von Propolinen positiv mit der Ethanolkonzentration während der Extraktion in Verbindung gebracht zu werden, wobei die höchste Ausbeute an Propolinen in den 95%- und 99,5%-Ethanolextrakten erzielt wird. Anschließend werden die antibakteriellen Auswirkungen der Ethanolextrakte gegen s aureus und E coli untersucht.
Die durchschnittliche minimale hemmende Konzentration für S aureus scheint zwischen 10 und 20 Mikrogramm pro Milliliter zu liegen und die durchschnittliche bakterielle Konzentration scheint 20 Mikrogramm pro Milliliter zu liegen. Wasserextrakte hatten jedoch keine antibakterielle Wirkung gegen S aureus. Bei Verwendung der Wasser- oder Ethanolextrakte wird keine antibakterielle Wirkung für E coli beobachtet.
Eines der wichtigsten experimentellen Verfahren ist die Vermeidung der Gleichförmigkeit der taiwanesischen grünen Propolis während des Schleifens.
