Die Gamma-Delta-T-Zellen haben eine starke zytotoxische Aktivität gegen viele Krebsarten, einschließlich akuter myeloischer Leukämie. Zirkulierende Gamma-Delta-T-Zellen in einem Blut sind jedoch relativ selten, insbesondere bei Patienten mit malignen Erkrankungen. Die Infusion von spenderabgeleiteten, X-vivo expandierten Gamma-Delta-T-Zellen ist vielversprechend, um das Wiederauftreten von Leukämie zu reduzieren und das Überleben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie zu verbessern.
Die vorgeschlagene Methode erreicht in drei einfachen Schritten eine mehr als 200.000-fache Gamma-Delta-T-Zellexpansion und erreicht therapeutisch relevante Dosen eines hochreinen Gamma-Delta-T-Zellprodukts. Also Ligating eines IEL zur Expansion, Alpha-Beta-T-Zell-Depletion durch magnetische Sortierung und Bounty-Sekundärexpansion mit AAPCs. Die vorgeschlagene Methode erweitert den Nutzen von Gamma-Delta-T-Zellen für Krankheiten wie Krebs und Autoimmunerkrankungen, indem sie schnell eine große Anzahl von Zellen erzeugt, die von der Stange verwendet werden können.
Dieser Prozess könnte angepasst werden, um Gamma-Delta-Zellen mit verschiedenen Anreicherungsmethoden zu erweitern und zusätzliche Manipulationen wie Transduktion hinzuzufügen. Die Demonstration des Verfahrens wird in LA, einem Zelltherapie-Technologen, drei aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Elutriation der Brauseproduktprobe auf der Gegenstromzentrifugationsvorrichtung unter Verwendung eines primären Mediums der ausgewogenen Hanks-Salzlösung mit 1% humanem Serumalbumin und dem sekundären Medium der Kochsalzlösung oder DPBS.
Mit der Elutriationszentrifugationsgeschwindigkeit bei 900 mal G sammeln Sie Fraktionen basierend auf Durchflussrate und Zeit. Sammeln Sie die Proben aus dem zweiten Bruchteil, um die Sterilitätstests, die Zellzahl und die Zellphänotypisierung durch Durchflusszytometrie durchzuführen. Von Der zweiten Fraktion expandieren Sie eine reine Lymphozytenfraktion von Zellen in Kultur bei 10 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Zentimeter im Quadrat, mit fünf Mikromol pro Liter Zoledronsäure und 300 Einheiten pro Milliliter Interleukin-2 in einem Ein-Liter-Bioreaktor mit geschlossenem System.
Inkubieren Sie das System sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach der Inkubation ernten Sie Zellen aus dem Ein-Liter-Bioreaktorkolben mit geschlossenem System. Schweißen Sie dazu ein Ein-Liter-Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors und verwenden Sie die entsprechende pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen.
Nehmen Sie die Proben zur Untersuchung der verbrauchten mittleren Sterilität, der Zellzahl und der Zellphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie. Aus der verbleibenden Probe werden die Zellen fünfmal 10 bis acht Zellen pro Milliliter im PBS-EDTA-Puffer mit 0,5% HSA und biotinyliertem T-Zell-Rezeptor, Alpha-Beta-spezifischem Antikörper, erneut suspendiert. Und die Zellen bei zwei bis acht Grad Celsius mit Schütteln inkubieren.
Nach 15 Minuten waschen Sie die Zellen mit 600 Millilitern PBS-EDTA-Puffer mit 0,5 HSA und zentrifugieren Sie bei 200 bis 500 mal G für 15 Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. Dann suspendieren Sie die Zellen bei etwa fünf mal 10 bis acht Zellen pro Milliliter in PBS-EDTA-Puffer, der 0,5% HSA und 7,5 Milliliter pro Fläschchen antibiotinspezifischer Mikrokügelchen enthält. Wie bereits beschrieben, inkubieren Sie die Zellen mit Schütteln, bevor Sie die Zellsuspension zentrifugieren, um die ungebundenen Mikrokügelchen zu entfernen.
Sechsmal 10 bis zur siebten Zelle pro Milliliter im PBS-EDTA-Puffer mit 0,5% HSA erneut suspendieren. Sammeln Sie sie in einer Transfertasche. Spiken Sie es, wenn Sie vom Instrument angewiesen werden.
Als nächstes installieren Sie ein Schlauchset in der magnetischen Zelltrennvorrichtung in klinischer Qualität. Legen Sie die Packungen mit dem PBS-EDTA-Puffer und die Transferpackung mit dem Zellprodukt in das Gerät. Für die Depletion der markierten Alpha-Beta-T-Zellen wählen Sie das Depletion 1.2-Protokoll in der Software aus.
Dann zentrifugieren Sie das Zellprodukt, um die mit Gamma-Delta-T-Zellen angereicherte Zielfraktion zu sammeln. Suspendieren Sie die gesammelten Zellen in dem Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Führen Sie eine Zellzahllebensfähigkeit und Durchflusszytometrie Phänotypisierung nach der Depletion durch.
Bringen Sie Zellen auf eine Endkonzentration von etwa einem mal 10 bis zur sechsten Zelle pro Milliliter. Bestrahlen Sie fünfmal 10 bis zur siebten künstlichen Antigen-präsentierenden Zelle oder AAPCs pro Kolben bei 100 Grau auf dem röntgenerzeugenden Instrument. Bereiten Sie eine Kokultur vor, indem Sie die bestrahlten AAPCs und Gamma-Delta-T-Zellen im Verhältnis von 10 zu eins in einem Liter geschlossenen System-Bioreaktorkolben platzieren.
Mit einem Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum, samen Sie bis zu 10 Kolben. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 10 Tage, mit einem Screening der Glukose- und Laktatspiegel alle drei bis vier Tage mit Streifen, Glukose und einem Laktatmessgerät. Wenn der Glukosespiegel auf 215 Milligramm pro Deziliter sinkt, reduzieren Sie das Volumen im Kolben auf 200 Milliliter.
Mischen Sie die Zellen in die verbleibenden 200 Milliliter Medien und entfernen Sie eine 0,5 Milliliter Probe für die Zellzählung und Lebensfähigkeitsmessung durch Acridinorange oder Propidiumiodid-Färbung. Wenn die Zellzahl gleich oder größer als 10 bis neunt ist, teilen Sie den Inhalt eines Kolbens in zwei auf und füllen Sie jeden Kolben bis zu einem Liter mit AIM-V-Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Wenn die Zellzahl weniger als 10 bis neunt beträgt, füttern Sie die Zellen mit einem frischen Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% menschlichem AB-Serum, und geben Sie die Kolben in den Inkubator zurück.
Am Ende von 10 Tagen in Co-Kultur ernten Sie die Bioreaktorkolben nacheinander und ziehen Sie alle Zellen in eine Transferpackung von geeigneter Größe. Nachdem Sie die Qualitätskontrollproben entnommen haben, zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 bis 500 mal G für 15 Minuten bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen in einer Lösung aus ausgewogener kristalloider Lösung, ergänzt mit 0,5% HSA bei 200 bis 500 mal G für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Suspendieren Sie sie erneut in einem Zielvolumen von 100 bis 300 Millilitern ausgewogener kristalloider Lösung mit 0,5% HSA. Die Zellen trennten sich von der Post-Counterflow-Zentrifugationsfraktion. Zwei ergaben eine reine Lymphozytenpopulation mit einer ausgezeichneten durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 95,80%Die spezifische Expansion der Gamma-Delta-T-Zellen mit Zoledronsäure hing vom anfänglichen Prozentsatz der natürlichen Killerzellen ab, die nach der Elutriation in der Lymphozytenfraktion vorhanden waren.
Die Anreicherung der Gamma-Delta-T-Zell-Wirkstoffsubstanz mit T-Zell-Rezeptor-Alpha-Beta-Depletion war konsistent. Das Gamma-Delta T-Zell-Arzneimittel, das aus drei gesunden Spendern hergestellt wurde, erfüllte das Freisetzungskriterium von weniger als 1% der T-Zell-Rezeptor-Alpha-Beta-positiven T-Zellen, mit durchschnittlich 0,11% CD20-positiven B-Zellen und 0,00% T-Zell-Rezeptor-Alpha-Beta-positiven T-Zellen. Der durchschnittliche Prozentsatz an natürlichen Killerzellen im Endprodukt betrug etwa 17,06%, was das Freisetzungskriterium von weniger als 35% erfüllte Zelloberflächenfärbung und durchflusszytometrische Analyse wurden verwendet, um die Identität, Reinheit und Prozessverunreinigungen der Arzneimittelsubstanz und des Arzneimittels zu charakterisieren.
Die zweite erneute Erweiterung, die aus der Kokultur der AAPC- und Gamma-Delta-T-Zell-Wirkstoffsubstanz erreicht wurde, erzeugte ein Gamma-Delta-T-Zell-Arzneimittelprodukt, das alle Freisetzungskriterien erfüllte. Pathons, die die T-Zell-Population anreichern, beeinflussen die Expansion und die Eigenschaften des Produkts. Vor Beginn ihres Anreicherungsprozesses ist eine ausreichende Prüfung und Untersuchung der Anreicherungsmethoden erforderlich.
