Mit diesem Protokoll können hochwertige bakterielle Zelllysate nur mit allgemein verfügbaren Laborgeräten hergestellt werden, so dass die zellfreie Genexpression für die meisten Forscher leicht zugänglich ist. Die Kombination der zellulären Autolyse des Programms mit einem Gefrier-Tau- oder Gefrier-Trocken-Zyklus ermöglicht die Schaffung eines praktischen, arbeits- und kostengünstigen Ansatzes für die schnelle Produktion von Bakteriellen Lysaten für die zellfreie Genexpression. Beginnen Sie mit einer Impfschleife, um die Zellen eines Autolyse-E. coli-Stammes auf LB-Agarplatten mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin zu streifen, und inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag wird mit einer Pipettenspitze eine einzelne Kolonie aus der Agarplatte entnommen und in ein Kulturröhrchen gegeben, das LB-Medium mit Ampicillin enthält. Bauen Sie diese Starterkultur über Nacht bei 37 Grad Celsius an. Am nächsten Tag werden 400 Mikroliter der Starterkultur in einen Ein-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben, der 400 Milliliter 2xYTPG-Medium enthält, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.
Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 300 U / min. Messen Sie mit einem Spektralphotometer und einer optischen Küvette mit einer Weglänge von einem Zentimeter regelmäßig die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern. Wenn die optische Dichte eins überschreitet, beginnen Sie vor den Messungen mit der fünffachen Verdünnung der Kultur, um sicherzustellen, dass die Messungen im linearen Bereich eines typischen Laborspektrophotometers bleiben.
Sobald die optische Dichte der fünffach verdünnten Kultur 0,3 erreicht hat, nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fahren Sie mit der Vorbereitung des Lysat fort. Um das Lysat vorzubereiten, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.800 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand ab und entfernen Sie die restliche Flüssigkeit mit einer Pipette.
Fügen Sie dem Pellet 45 Milliliter kalten S30A-Puffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch Wirbeln. Wiegen Sie dann ein leeres 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, bevor Sie die Zellen in das Röhrchen übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und verwerfen Sie den Überstand.
Aspirieren Sie den verbleibenden Überstand mit einer Pipette. Wiegen Sie das Rohr erneut und subtrahieren Sie das Gewicht des leeren Rohres von dem angezeigten Gewicht, um das Gewicht des Pellets zu erhalten. Für jedes Milligramm Zellpellet fügen Sie zwei Mikroliter kalten S30A-Puffer hinzu, der mit zwei Millimolar-Dithiothreitol ergänzt wird.
Dann resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Wirbeln. Als nächstes frieren Sie die Zellen ein, indem Sie sie in einen minus 20 oder minus 80 Grad Celsius gefrierenden Gefrierschrank legen, bis das Pellet gründlich eingefroren ist, dann die Zellen in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auftauen und zwei bis drei Minuten lang kräftig wirbeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten mit Schütteln bei 300 U / min und reinigen Sie dann die Probe von schweren Zelltrümmern, indem Sie sie in transparenten Zentrifugenröhrchen bei 30.000 x g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in ein neues Röhrchen überführen, wobei darauf zu achten ist, das Pellet nicht zu stören. Wenn der übertragene Überstand mit Material aus dem Pellet kontaminiert ist, wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand in 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen überführen.
Und noch einmal mit 21.000 x g oder der maximalen Geschwindigkeit einer Tischzentrifuge für fünf Minuten zentrifugieren. Aliquot das gereinigte Autolysat in gewünschte Mengen und lagern bei minus 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch. Für die zellfreie Genexpression mit dem Autolysat mischen Sie acht Mikroliter Autolysat und 8,9 Mikroliter Pre-Mix auf Eis.
Fügen Sie DNA zu einer Endkonzentration von acht Nanomol, andere notwendige Reagenzien und Wasser hinzu, um ein endgültiges Volumen von 20 Mikrolitern zu erhalten. Fügen Sie die Reaktion zu einer 384-Well-Mikroplatte hinzu und verwenden Sie einen Plattenleser, um den Fluoreszenzzeitverlauf und die Endpunkte zu messen. Die GFP-Expression unter Verwendung des Autolysats mit einer Verdünnungsreihe von Plasma-DNA führt zu einer starken Expression selbst bei einer nanomolaren DNA.
Beim Vergleich der GFP-Expression zwischen einem kommerziell erhältlichen Lysat und dem Autolysat ergab das Autolysat vergleichbare GFP-Werte. Die Variabilität zwischen Lysatchargen, die in zwei verschiedenen Labors von verschiedenen Forschern hergestellt wurden, betrug etwa das Doppelte. Die drei kritischsten Variablen sind das Verhältnis von Zellpellets zu Puffer, die Übertragung von schmutzfreiem Überstand und die Verwendung einer optimalen PEG- und Magnesiumkonzentration in der endgültigen Reaktion.
Sobald der Extrakt vorbereitet ist, kann ein großes Arsenal bestehender Protokolle verwendet werden, die für zellfreie E.coli-Expressionssysteme entwickelt wurden, wie z. B. ClpXP-vermittelte Degradation oder AHL-vermittelte Quorum-Sensing.
