Die Kombination extrazellulärer Vesikel mit Biomaterialien ist ein wünschenswerter Ansatz für Studien zur regenerativen Medizin. So berichtet diese Studie über die Titanfunktionalisierung mit EVs als praktisches Werkzeug für die Orthopädie und Knochenregeneration. Die Tropfengussfunktionalisierung ist eine einfache und kostengünstige Methode im Vergleich zu anderen Strategien wie polymerem Einfangen oder biochemischer Bindung.
Beginnen Sie mit der Funktionalisierung der Titanoberfläche, indem Sie die Titanscheiben mit entionisiertem Wasser in einem Glasbecher waschen. Entsorgen Sie dann das Wasser, bevor Sie die Scheiben mit 70% Ethanol waschen. Dekantieren Sie die Lösung, um die gewaschenen Implantate bei 50 ° C für fünf Minuten in deionisiertem Wasser zu beschallen.
Nach dem Entsorgen des Wassers inkubieren Sie Titanimplantate in einer 40% igen Natriumhydroxidlösung bei 50 ° C für 10 Minuten unter Rühren und beschallen Sie dann die Implantate in deionisiertem Wasser wie gezeigt. Als nächstes führen Sie mindestens fünf Wäschen der Implantate mit deionisiertem Wasser durch. Bis der pH-Wert auf dem pH-Indikator neutral ist.
Wiederholen Sie den Beschallungs- und Inkubationsprozess, wie zuvor erläutert, indem Sie Natriumhydroxid durch 50% Salpetersäure ersetzen. Führen Sie die Wäschen und die Beschallung mit entionisiertem Wasser durch, bevor Sie die Implantate in einer 70% igen Ethanollösung lagern. Inkubieren Sie die Titanimplantate in einer 30%igen Salpetersäurelösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanfter Bewegung.
Nach der Inkubation mindestens fünf Wäschen mit entionisiertem Wasser durchführen, bis der pH-Wert bei den pH-Indikatoren neutral ist. Dann Titanimplantate über Nacht bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser inkubieren. Am nächsten Tag trocknen Sie die Implantate unter Vakuum bei 40 ° C für 10 Minuten ab.
Legen Sie unter dem Zellkulturschrank Titanimplantate in eine 96-Well-Platte mit der Maschinenseite nach oben. Ordnen Sie für die extrazellulären Vesikel EVs Drop Casting durch Auftauen von EVs Lösung und Vortexing Lösung bei einem Impuls von drei Sekunden. Nach dem Mischen 40 Mikroliter der EVs-Lösung auf der Titanoberfläche abscheiden, um maximal 4 x 10 ^ 11 EVs pro Implantat zu immobilisieren, entsprechend der Konzentration, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt wurde.
Als nächstes stellen Sie die Platten unter Vakuumbedingungen bei 37 ° C für ungefähr zwei Stunden oder bis die Tropfen vollständig trocken sind. Stellen Sie die Trocknungszeit in Abhängigkeit von der Anzahl der Titanimplantate und dem in der Vakuumkammer vorhandenen Wasser ein. Die Menge der aus Titanscheiben freigesetzten EVs wurde durch Nanopartikel-Tracking-Analyse gemessen.
An Tag 2 wurden rund 10^9 EVs freigegeben, gefolgt von einer anhaltenden Freisetzung an den Tagen 6, 10 und 14. Die In-vitro-Zellbiokompatibilität der Titan-EVs wurde mit Laktatdehydrogenase oder LDH-Freisetzungsassay 48 Stunden nach der Zellaussaat auf den Implantaten beurteilt. Titan-EVs zeigten eine geringere Menge an LDH als der maximal akzeptierte zytotoxische Wert.
Während die Titan-Kontrollgruppe höhere LDH-Aktivitätsniveaus zeigte. Der wichtigste Schritt ist die Vakuumtrocknung des beschichteten Implantats. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das gesamte Wasser verdampft wird, um eine optimale Physisorption zu erreichen.
