Innerhalb der Embryonen interagieren Zellen miteinander und tauschen chemische und mechanische Informationen aus. Eine effiziente Möglichkeit, diese Wechselwirkungen zu untersuchen, besteht darin, einige Zellen abzutöten und die Folgen für benachbarte Zellen zu überwachen. Die Methode, die wir beschreiben, ermöglicht es uns, Zellen, auch innerhalb des Embryos, genau abzutragen, ohne benachbarte Gewebe zu schädigen.
Bereiten Sie das Zwei-Photonen-Mikroskop vor, indem Sie den ersten Laser auf die Ablationswellenlänge von 820 Nanometern und den zweiten Laser auf die mCherry-Bildgebungswellenlänge 1.160 Nanometer einstellen. Richten Sie mit beweglichen Spiegeln auf dem Strahlenweg die beiden Laserstrahlen am Ein- und Austritt der Scanköpfe aus und messen Sie dann die maximale Leistung des ersten Lasers auf 820 Nanometern. Platzieren Sie den Leistungsmesser unter dem Objektiv, schließen Sie die schwarze Kammer und stellen Sie die erste Laserleistung auf 100% ein Starten Sie die Datenerfassung auf dem Leistungsmesser, öffnen Sie den Laserverschluss, messen Sie dann die Ausgangsleistung und berechnen Sie den Prozentsatz der Laserleistung, der benötigt wird, um 300 Milliwatt zu erreichen.
Stellen Sie den ersten Laser auf die GFP-Anregungswellenlänge von 920 Nanometern und die Leistung auf 7% ein Stellen Sie die zweite Laserleistung auf 15% ein Aktivieren Sie die PMT-Detektoren für grüne und rote Linien und stellen Sie die PMT-Empfindlichkeit der grünen und roten Linie auf 65 ein. Stellen Sie das Sichtfeld auf 400 x 400 Mikrometer, die Bildauflösung auf 512 x 512 Pixel und die Abtastfrequenz auf 800 Hertz ein. Wählen Sie den 3D-Zeitraffer-Bildgebungsmodus, erstellen Sie dann einen Ordner und aktivieren Sie Das automatische Speichern, um nach jeder Erfassung Daten zu speichern.
Montieren Sie die Heizkammer und stellen Sie sie auf 28 Grad Celsius ein. Warten Sie mindestens 10 Minuten, bis sich die Kammer erwärmt hat. Identifizieren Sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop Embryonen mit einer Epiboly von 70%, die GFP exprimieren.
Sie übertragen mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff drei bis vier ausgewählte Embryonen in die mit Agarose beschichtete Schale und dehorionieren sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette. In einer kleinen Glasfläschchen einen Milliliter einer Lösung von Penicillin-Streptomycin Embryo Medium mit 2% Agarose hinzufügen und die Durchstechflasche in eine vorgewärmte, trockene Blockheizung bei 42 Grad Celsius geben. Übertragen Sie mit einer feuerpolierten Glaspipette einen dehorionierten Embryo in die Durchstechflasche, wobei darauf zu achten ist, der Agarose nicht zu viel Embryomedium hinzuzufügen.
Entsorgen Sie das verbleibende Embryomedium aus der Pipette. Aspirieren Sie den Embryo zurück, zusammen mit genügend Agarose, um den Objektträger der Glasbodenschale abzudecken. Blasen Sie die Agarose mit dem Embryo auf den Glasträger der Schale, um sicherzustellen, dass der Embryo die Luft oder die Kunststoffseite der Schale nicht berührt.
Füllen Sie dann die Kammer um den Glasobjektträger mit Agarose. Richten Sie den Embryo mit einer Wimper so aus, dass sich die Zielregion an der Spitze befindet. Nach fünf Minuten, wenn die Agarose vollständig eingestellt ist, fügen Sie ein paar Tropfen Penicillin-Streptomycin-Embryomedium in den Glasobjektträger hinzu.
Stellen Sie die Glasbodenschale unter das Objektiv in die beheizte Kammer. Tauchen Sie das Objektiv in das Penicillin-Streptomycin-Embryomedium ein, bevor Sie die Kammer schließen. Bewegen Sie den Schieberegler, um den Lichtpfad auf das Okular festzulegen.
Schalten Sie die Leuchtstofflampe ein. Finde einen Embryo und setze den Fokus auf seine Oberfläche. Schalten Sie die Fluoreszenzlampe aus und stellen Sie den Lichtweg zu PMTs ein, bevor Sie die schwarze Kammer schließen.
Starten Sie die Live-Bildgebung und lokalisieren Sie das axiale Mesoderm. Um ein gutes Signal zu erhalten, passen Sie die Laserleistungen an. Verwenden Sie den roten Kanal, um das Stadium ganz nach oben auf den Embryo zu bewegen, und weisen Sie diese Position zu, da Z gleich Null ist.
Wählen Sie einen Zeitschritt von einer Minute und einen Z-Schritt von zwei Mikrometern. Stellen Sie die erste Scheibe auf 15 Mikrometer über dem axialen Mesoderm und die letzte Scheibe auf 15 Mikrometer unter dem axialen Mesoderm. Nehmen Sie 10 bis 15 Minuten eines Films vor der Ablation auf.
Suchen Sie bei live imaging die Polsterkontur, zeichnen Sie dann mit dem interessierenden elektrooptischen Modulatorbereich oder EOM-ROI-Tool ein 20 Pixel großes Rechteck, das sich über die Breite des Polsters erstreckt, und platzieren Sie das Rechteck in der Mitte des Polsters. Beachten Sie die axiale Position der höchsten und niedrigsten Ebene, die abgetragen werden sollen, um sicherzustellen, dass der ROI to die Dotterzelle auf keiner der Ebenen überlappt. Stellen Sie die Bühne in die niedrigste Z-Position, um abgetragen zu werden.
Stellen Sie die erste Laserwellenlänge auf 820 Nanometer ein und geben Sie den zuvor berechneten Leistungsprozentsatz ein, um eine Ausgangsleistung von 300 Milliwatt zu erhalten. Stellen Sie die Abbildungsfrequenz auf 200 Hertz und die erste Laserbildgebungs-EOM auf Null. Nachdem Sie den ROI Treat-Modus ausgewählt haben, deaktivieren Sie die EOM und stellen Sie die Behandlung so ein, dass sie sofort nach Null Frame beginnt.
Stellen Sie den Imaging-Modus auf Timelapse und deaktivieren Sie das automatische Speichern. Nachdem Sie im Zeitschritt den Modus "Schnell" ausgewählt haben, passen Sie die Anzahl der Behandlungsrahmen und die Anzahl der Frames an den Wert an, der der Zieltiefe entspricht. Starten Sie die Bildgebung.
Die Erfassung sollte schwarz sein, da sich der Verschluss für PMT während der EOM-Behandlung schließt. Bewegen Sie sich als Nächstes die Stufe hinauf zur nächsten Z-Position und führen Sie auf ähnliche Weise eine Ablation durch. Wiederholen Sie dies auf jeder Z-Position, bis die Oberseite der Polster erreicht ist.
Wenn der Prozess der Ablation abgeschlossen ist, stellen Sie den ersten Laser auf 920 Nanometer und stellen Sie sich auf die zuvor gewählte Bildgebungsleistung ein. Setzen Sie die erste Laser-Imaging-EOM auf 100 und entscheiden Sie sich für den Vollfeldmodus. Die Abbildungsfrequenz sollte 800 Hertz betragen, und EOM sollte ausgeschaltet werden, bevor der gesamte Stack im Live-Modus untersucht wird, um zu überprüfen, ob jedes Flugzeug abgetragen wurde.
Sobald die Ablation bestätigt wurde, wählen Sie 3D Time lapse als Bildgebungsmodus. Aktivieren Sie das automatische Speichern erneut, und beginnen Sie mit der Aufnahme des Films nach der Ablation für 40 bis 60 Minuten. Überprüfen Sie im Film nach der Ablation, ob die Zielzellen effektiv abgetragen wurden.
Da Ablationen über die Polster die Embryonen nicht schädigen sollten, kann die normale Morphologie der abgetragenen Embryonen bis zu 24 Stunden nach der Befruchtung beobachtet werden. Im erfolgreichen Ergebnis der Laserablationen wurden die überlagernden Gewebe nicht durch die Ablation der darunter liegenden Strukturen beeinflusst. Eine zu intensive Behandlung oder zu wenig Behandlung führte zu Fehlschlägen bei der Laserablation.
Ein Beispiel für eine erfolglose Ablation zeigt, wie Zellen oberhalb des Polsters abgetragen werden, was durch autofluoreszierende Trümmer in der Brennebene über der Polsterung offensichtlich war. In einem weiteren ineffektiven Versuch wurden Zellen gebleicht, aber nicht abgetragen, und Signale mit niedriger Fluoreszenz zeigen immer noch die intakten Zellkonturen. Schließlich wurden einige Zellen aufgrund einer unzureichenden Laserbehandlung nicht einmal gebleicht.
Die Bildung von Blasen ist auf Kavitation zurückzuführen, die durch eine zu intensive Laserbehandlung induziert wird. Z-Stacks wurden jede Minute für 40 Minuten in einer erfolgreichen Ablation erfasst, wobei sowohl die zytoplasmatischen GFP- als auch die nuklearen mCherry-Signale aufgezeichnet wurden. Darüber hinaus werden Kerne, die zur vorderen Hälfte der Polster gehören, mit einem magentafarbenen Punkt markiert und vor und nach der Ablation über die Zeit verfolgt.
Als Maß für die Persistenz der Migration wurde die Richtungsautokorrelation von Zellen vor und nach der Ablation untersucht. Zellen, die zum vorderen Teil der Polster gehörten, zeigten vor der Ablation eine anhaltende Bewegung, die nach der Ablation drastisch abnimmt, was auf einen Verlust der kollektiv orientierten Migration hinweist. Die richtige Ausrichtung der Laser und die Messung der Laserleistung sind entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Es ist auch wichtig, die Ablationseffizienz auf den ersten Bildern nach der Ablation zu überprüfen. Wir verwenden Laserablationen, um die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen bei der Steuerung der Migration von Zellen innerhalb des Embryos zu hinterfragen. Aber das Verfahren könnte leicht an viele andere Fragen angepasst werden, bei denen Zellen oder Gewebe präzise abgetragen werden müssen, möglicherweise tief im Organismus.
