Die zellfreie Autoinduktionsmethode reduziert die Aufsicht der Forscher und die Zeit, die für die Herstellung funktioneller Zellextrakte benötigt wird. Dies vereinfacht frühere In-vitro-Proteinsyntheseprotokolle, die zeitaufwendiger und intensiver waren. Diese Technik ist weniger kompliziert und auch ertragreich, was es einem größeren Publikum ermöglicht, zellfreien Ausdruck zu implementieren.
Diese Methode unterstreicht die Bedeutung des Energiestoffwechsels während des Zellwachstums und innerhalb zellfreier Reaktionen. Beginnen Sie mit der Herstellung von 960 Millilitern zellfreier Autoinduktionsmedien. Sterilisieren Sie dann das Medium in einem 2,5-Liter-Kolben, indem Sie 30 Minuten bei 121 Grad Celsius autoklavieren.
Als nächstes, nach der Zubereitung von 40 Millilitern der Zuckerlösung, sterilisieren Sie es in einen separaten Autoklavglasbehälter. Nach dem Autoklavieren, wenn das Nährmedium auf unter 40 Grad Celsius abgekühlt ist, geben Sie die filtersterilisierte Zuckerlösung direkt in das Medium. Als nächstes impfen Sie die Medien, indem Sie eine Schleife voller Kolonien von einer zuvor gestreiften frischen E.coli BL21-Sternplatte streichen und die Schleife direkt in das Medium einführen.
Schwenken Sie die Schlaufe in das Medium, ohne die Seiten des Behälters zu berühren. Legen Sie dann das geimpfte Medium über Nacht in einen 30 Grad Celsius-Inkubator mit Schütteln bei 200 U / min. Am nächsten Tag ernten Sie die Zellen, indem Sie einen Liter des Mediums in eine Ein-Liter-Zentrifugenflasche geben und bei 5.000 mal G zwischen vier und 10 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie einen sterilen Spatel, um das Pellet in ein vorgekühltes und zuvor gewogenes 50-Milliliter-konisches Rohr zu überführen. Als nächstes waschen Sie das Pellet einmal mit 30 bis 40 Millilitern kaltem S30-Puffer, indem Sie das Pellet durch Vortexing in 30-Sekunden-Ausbrüchen mit Ruhephasen auf Eis wieder aufhängen. Nachdem das Pellet vollständig resuspendiert wurde, zentrifugieren Sie die Zellresuspension, entsorgen Sie den Überstand und wischen Sie mit einem sauberen Gewebe überschüssigen Überstand von den Innenwänden des 50-Milliliter-Rohrs, ohne das Pellet zu berühren.
Dann wiegen Sie das Pellet, bevor Sie es in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und lagern Sie es bis zum weiteren Gebrauch bei minus 80 Grad Celsius. Um den Zellextrakt herzustellen, fügen Sie einen Milliliter S30-Puffer pro Gramm des gefrorenen Zellpellets hinzu und lassen Sie das Pellet 30 bis 60 Minuten auf Eis auftauen. Dann suspendieren Sie das aufgetaute Pellet durch Vortexing in Ausbrüchen von 30 Sekunden mit Ruhephasen auf Eis, bis keine sichtbaren Zellklumpen mehr übrig sind.
Für die Zelllyse übertragen Sie 1,4 Milliliter Aliquots der Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen. Dann beschallen Sie die Zellsuspension in jeder Röhre mit einer Frequenz von 20 Kilohertz und 50% Amplitude für drei Ausbrüche von 45 Sekunden mit 59 Sekunden Ruhe pro Zyklus in einem Eisbad Kehren Sie die Röhre zwischen den Zyklen um und fügen Sie nach dem letzten Beschallungszyklus sofort 4,5 Mikroliter einmolares Dithiothreitol hinzu. Nachdem Sie die Zellsuspension in allen Röhrchen beschallt haben, zentrifugieren Sie die Röhrchen und sammeln Sie den Überstand in 600-Mikroliter-Aliquots in frischen 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen.
Die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung einfrieren und lagern. Um 15 Mikroliter zellfreie Proteinsynthesereaktion in 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen in Vierfacher durchzuführen, tauen Sie ein Aliquot des Zellextrakts auf. Lassen Sie die Reaktion nach der Zubereitung jedes 15-Mikroliter-Reaktionsgemisches mindestens vier Stunden bei 37 Grad Celsius laufen.
Um das Reporterprotein zu quantifizieren, kombinieren Sie 48 Mikroliter 50-millimolären HEPES-Puffer bei pH 7,2 mit zwei Mikrolitern jedes zellfreien Proteinsynthese-Reaktionsprodukts in einer schwarzen Polystyrol-96-Well-Platte. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität des Superordners grün fluoreszierendes Protein (sfGFP) unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 485 und einer Emissionswellenlänge von 528 Nanometern. Konvertieren Sie dann die relativen Fluoreszenzeinheiten in die volumetrische Ausbeute von sfGFP, indem Sie eine Standardkurve mit gereinigtem pJL1-sfGFP-Plasmid erstellen.
Hier sind zellfreie Autoinduktionsmedienpellets nach Zellernte bei unterschiedlichen optischen Dichten gezeigt, gemessen bei 600 Nanometern. Das auf eine optische Dichte von 10 gewachsene Medium produzierte eine höhere Menge an Zellpellet im Gesamtextrakt als das auf eine optische Dichte von 2,5 gewachsene Medium. Eine weitere Analyse der Gesamtproteinkonzentration zeigte keinen signifikanten Unterschied im Gesamtprotein zwischen beiden Extrakten.
Obwohl das Medium auf unterschiedliche optische Dichtegrade gezüchtet wurde, zeigten beide Extrakte ähnliche Ergebnisse bei zellfreien Reaktionen, die sfGFP exprimierten. Die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während der Zubereitung der Medien und der Zuckerlösung ist wichtig. Diese CFAI-Zellextraktionsmethode kann für die meisten Anwendungen des zellfreien Ausdrucks verwendet werden.
Diese reichen von der biotechnologischen Ausbildung über das Protein-Engineering bis hin zur Point-of-Care-Diagnostik. Diese Methode reduziert den Zeitaufwand und die erforderlichen technischen Fähigkeiten, verbessert die Reproduzierbarkeit und produziert höhere Mengen an Extrakt.
