Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es detailliert beschreibt, wie aus einem kleinen Genfragment, das von einer Syntheseanlage erhalten wird, schnell große Mengen an DNA-Vorlagen für die Verwendung in zellfreien Reaktionen erzeugt werden können. Die Rolling Circle Amplification kann große Mengen an DNA schneller erzeugen als herkömmliches Klonen. So unterstützt es höhere Durchsatz-Design-Build-Test-Lernzyklen aus Bibliotheken synthetischer DNA.
Diese Techniken können für neue Benutzer aufgrund der vielen Erforderlichen Schritte und kleinen Volumina eine große inhärente Variabilität aufweisen. Sorgfältige Aufmerksamkeit sollte der Technik geschenkt werden, und Übung macht den Meister. Fügen Sie zunächst alle Komponenten aus einem PCR-Kit in einem einzigen PCR-Röhrchen hinzu.
Fügen Sie dann einen Mikroliter des resuspendierten Genfragments hinzu. Homogenisieren Sie die Mischung vorsichtig, indem Sie fünf bis 10 Sekunden lang auf einer mittleren Einstellung wirbeln. Nachdem Sie den Thermocycler gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers programmiert haben, führen Sie die PCR aus.
Verwenden Sie nach Abschluss der PCR ein PCR-Cleanup-Kit, um die DNA aus der Reaktionsmischung zu reinigen. In einem 1,5-Milliliter-Röhrchen den DNA-Bindungspuffer und die PCR-Probe im Verhältnis fünf zu eins hinzufügen. Dieses Gemisch in die Spinsäule geben und eine Minute lang bei 16.000 mal G zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Durchfluss. Geben Sie 200 Mikroliter des DNA-Waschpuffers in die Säule und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur für eine Minute. Zentrifugieren Sie die Säule erneut und verwerfen Sie den Durchfluss.
Waschen Sie die Säule noch einmal mit dem DNA-Waschpuffer, wie gezeigt. Nachdem Sie den Durchfluss aus der zweiten Wäsche verworfen haben, entfernen Sie den verbleibenden Puffer, indem Sie die Säule für weitere ein bis zwei Minuten zentrifugieren. Um die DNA zu eluieren, übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Dann fügen Sie 46 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in die Säule hinzu. Sammeln Sie nach einer einminütigen Inkubation die DNA durch Zentrifugation in die Röhre. Und quantifizieren Sie die gereinigte DNA mit einem Spektralphotometer.
Um die DNA zu verdauen und zu zirkulieren, kombinieren Sie fünf Mikroliter des notwendigen Reaktionspuffers, 20 Einheiten des HindIII-Restriktionsenzyms und 45 Mikroliter der gereinigten DNA in einem PCR-Röhrchen. Diese Mischung mit einer Pipette vorsichtig homogenisieren. Dann inkubieren Sie es in einem Thermocycler für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach Abschluss der Inkubation inaktivieren Sie das HindIII-Enzym durch Inkubation für 20 Minuten bei 80 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Mikroliter T4-Ligase-Puffer und 800 Einheiten T4-Ligase zur neu verdauten DNA hinzu. Nach dem vorsichtigen Mischen mit einer Pipette die Mischung für eine Stunde bei 25 Grad Celsius inkubieren, um die Zirkularisierungsreaktion durchzuführen.
Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, reinigen Sie die DNA mit einem PCR-Cleanup-Kit, wie zuvor gezeigt. Dann quantifizieren Sie die DNA. Um die Rollkreisverstärkung durchzuführen, kombinieren Sie alle Reaktionskomponenten und einen Mikroliter der gereinigten zirkularisierten Expressionsschablone in einem einzigen Röhrchen.
Homogenisieren Sie die Mischung mit einer Pipette und aliquot 10 Mikroliter der Mischung in vier separate Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 30 Grad Celsius für vier bis 18 Stunden, dann inaktivieren Sie das Enzym durch Inkubation bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Fördern Sie nach der Wärmeinaktivierung die Kondensation am Boden des Rohres, indem Sie fünf Minuten lang bei 12 Grad Celsius inkubieren.
Als nächstes verdünnen Sie die resultierende Lösung, indem Sie 15 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser zu jedem Röhrchen hinzufügen. Kombinieren Sie den Inhalt jedes Röhrchens, bevor Sie die DNA reinigen und quantifizieren, wie zuvor gezeigt. Um die zellfreie Reaktion durchzuführen, fügen Sie die verschiedenen erforderlichen Komponenten in ein Röhrchen hinzu und verdünnen Sie es mit doppelt destilliertem Wasser auf das gewünschte Endvolumen.
Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie die Hälfte der Lösung 10 bis 20 Mal nach oben und unten pipettieren. Das Reaktionsgemisch in 15-Mikroliter-Aliquots zu den gewünschten Vertiefungen in der Mikrotiterplatte überführen. Versiegeln Sie dann die Platte mit einem farblosen Dichtungsfilm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten und verdunstet zu verhindern.
Legen Sie die versiegelte Platte in den Plattenleser und lassen Sie die Reaktion bis zum Abschluss ablaufen. Wenn das Subtilisin BPN-Gen unter Verwendung des zellfreien Systems exprimiert wird, aliquot 94 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und ein Mikroliter 10 mikromolar PNA in einer flachen, farblosen 96-Well-Platte. Fügen Sie dann fünf Mikroliter der abgeschlossenen zellfreien Reaktion hinzu und lesen Sie die Platte mit einem Plattenleser ab, der die Absorption bei 410 Nanometern alle 20 Sekunden für 10 Minuten unter Beibehaltung einer Temperatur von 25 Grad Celsius misst.
Die Expression des Superfolder GFP im BL21 DE3-Sternextrakt mit nur 3 Mikrolitern ungereinigter RCA-DNA in einer 15-Mikroliter-Reaktion ist vergleichbar mit der des PJL1-Plasmids. Die Verdoppelung und Verdreifachung der Vorlagenmengen scheint keinen offensichtlichen Nutzen zu bieten, was auf bereits gesättigte Werte der Vorlage bei 3 Mikrolitern pro Reaktion hindeutet. Umgekehrt scheint es von Vorteil zu sein, die Menge der RCA-Vorlage zu erhöhen, wenn der Shuffle-Stammzellextrakt verwendet wird.
Proteine, die niedrigere Temperaturen oder längere Falzzeiten benötigen, beeinflussen die Zeit, die benötigt wird, um den gesamten Workflow abzuschließen. Zum Beispiel führt die Untersuchung von Subtilisin nach vier Stunden Expression zu einem fehlgeschlagenen Ergebnis, da vier Stunden für die Subtilisinreifung nicht ausreichen. Wenn die Reaktion jedoch bis zu 16 Stunden andauert, führt dies zu nachweisbaren Konzentrationen von Subtilisin.
Alle Komponenten müssen gut gemischt sein, damit dieses Protokoll mit maximaler Effizienz funktioniert. Nach diesen Methoden kann eine große Bibliothek von Proteinkandidaten synthetisch erzeugt und dann mit ausreichender Ausbeute für die Charakterisierung exprimiert werden. Diese Methode ebnete unserer Gruppe den Weg, zwei NC-Sensoren zu entwickeln, die in Zellextrakten arbeiten können, so dass wir das Prototypprotein schnell charakterisieren können.
Dies wird es uns ermöglichen, das Proteindesign neuer Biokatalysatoren und Therapien schneller und intelligenter zu iterieren.
