Die erfolgreiche Dissoziierung kleiner Mengen neuronalen Gewebes kann Labore in die Lage versetzen, strukturspezifische Einblicke in die Wirksamkeit der Behandlung, die Zellfunktion sowie die Krankheits- und Behandlungsmechanismen zu gewinnen. Dieses neuronale Dissoziationsprotokoll ergibt durchweg eine hochgradig lebensfähige und tatsächliche Einzelzellsuspension. Darüber hinaus können wir Proben verarbeiten, die nur einen Bruchteil derjenigen ausmachen, für die die kommerziellen Kits bestimmt sind.
Die richtige Planung und Vorbereitung sind der Schlüssel zu einem erfolgreichen Ergebnis für diese Technik. Es wäre von Vorteil, mehrere Übungsrunden durchzuführen, um sich mit dem Protokoll vertraut zu machen. Nach der Betäubung einer sechs Monate alten weiblichen C57BL / 6J-Maus klemmen Sie den Unterbauch ein und heben Sie die Haut mit einer Pinzette an.
Schneiden Sie dann mit einer Schere durch das Fell und die Haut bis zum Boden des Brustkorbs. Machen Sie zwei diagonale Einschnitte, die unterhalb des Brustkorbs beginnen und sich auf jede Schulter zubewegen. Sezieren Sie dann vorsichtig das Zwerchfell und den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
Nachdem Sie das Bindegewebe um das Herz herum vorsichtig entfernt haben, befestigen Sie mit einer Schere den rechten Vorhof. Schalten Sie dann den Isofluranfluss zum Entlüfter aus. Halten Sie das Herz mit einer Pinzette und mit der Fase der Schmetterlingsnadel nach oben stabil und durchbohren Sie den linken Ventrikel, während Sie die Nadel auf gleicher und parallel zum Tier halten.
Als nächstes halten Sie die Nadel an Ort und Stelle, schalten Sie die Pumpe ein und durchbluten Sie mindestens 30 Milliliter der Kochsalzlösung oder Heparinlösung, bis die Flüssigkeit, die das Herz verlässt, undurchsichtig ist und Leber und Lunge blass sind. Schalten Sie nach der Durchblutung die Pumpe aus, entfernen Sie die Nadel und bringen Sie die Maus in den Dissektionsbereich. Nach der Enthauptung schneiden Sie das Fell vom Hinterkopf bis zu den Augen ab und schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
Als nächstes befestigen Sie den Schädel zwischen den Augen und machen Sie zwei Schnitte an der Rückseite des Schädels in 10- und 2-Uhr-Positionen. Dann machen Sie einen langen Schnitt entlang der mittleren Linie des Schädels zum ursprünglichen Schnitt zwischen den Augen. Als nächstes ziehen Sie mit einer Pinzette die beiden Schädelhälften zu den Seiten.
Verwenden Sie dann einen Spatel, um das Gehirn zu entfernen, und legen Sie es in eine 60-Millimeter-Glas-Petrischale, die mit kaltem DPBS gefüllt und auf Eis gehalten wird. Trennen Sie mit einem Skalpell oder Rasiermesser jede Hemisphäre und entfernen Sie die Riechkolben und das Kleinhirn. Entfernen Sie dann das Mittelhirn, bis der Hippocampus freigelegt ist.
Als nächstes sichern Sie das Gehirn mit einer Pinzette. Dann mit einer zweiten Pinzette den Hippocampus vorsichtig aus jeder Hemisphäre herauskitzeln. Bringen Sie beide Hippocampi in eine beschriftete 1,5-Milliliter-Röhre mit kalten DPBS und legen Sie die Tube auf Eis.
Übertragen Sie die Hippocampi-Gewebestücke mit einer Pinzette in eine C-Röhre und fügen Sie 30 Mikroliter Enzymmischung 2 in die Röhre hinzu. Nachdem Sie die Kappe gedreht und festgezogen haben, bis sie klickt, legen Sie den Schlauch in einen Dissoziator und führen Sie das entsprechende Programm aus. Während das Programm läuft, benetzen Sie ein 70-Mikron-Zellsieb, das auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern BSA-Puffer platziert wird.
Nachdem das Dissoziationsprogramm abgeschlossen ist, fügen Sie dem dissoziierten Gewebe vier Milliliter BSA-Puffer hinzu und filtern Sie die Mischung durch das Zellsieb auf dem 50-Milliliter-Konusröhrchen. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter DPBS zur C-Röhre hinzu. Schließen Sie dann das Rohr, schwenken Sie die Lösung vorsichtig und filtern Sie es durch das Zellsieb auf dem 50-Milliliter-Konusrohr.
Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension, entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und lagern Sie das Pellet. Zur Schmutzentfernung suspendieren Sie das Pellet mit 1.550 Mikrolitern kaltem DPBS und übertragen Sie die Suspension auf ein beschriftetes 50-Milliliter-konisches Rohr. Dann fügen Sie 450 Mikroliter kalte Ablagerungslösung hinzu und pipettieren Sie auf und ab.
Überlagern Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einem Milliliter kaltem DPBS und halten Sie die Spitze an der Wand des konischen Rohres. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Gesamtüberlagerung zwei Milliliter beträgt. Als nächstes zentrifugieren Sie die Aufhängung bei 3.000 mal G für 10 Minuten mit voller Beschleunigung und voller Pause.
Aspirieren Sie die oberste Schicht und streichen Sie dann die Pipettenspitze hin und her, um die weiße mittlere Schicht abzuspulen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der mittleren Schicht, ohne die unterste Schicht zu stören. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter kalte DPBS hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um zu mischen.
Dann zentrigrieren Sie die Aufhängung bei 1.000 mal G für 10 Minuten mit voller Beschleunigung und voller Pause. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in einem Milliliter BSA-Puffer resuspendieren. Nach der Zellzählung zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension und resuspendieren das Pellet in 50 Mikrolitern verdünnter lebender toter Flecken.
Anschließend die Probe in ein markiertes Durchflussröhrchen überführen und bei Raumtemperatur für 8 bis 10 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie 500 Mikroliter BSA-Puffer hinzu und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Verwerfen Sie dann den Überstand und lassen Sie eine kleine Menge Puffer in der Röhre.
Das primäre Tor schloss Trümmer in den Vorwärtsstreu- gegenüber Seitenstreudiagrammen aus und die toten Zellen wurden anschließend ausgeschlossen. Das zweite Gate schloss Zellen aus, die positiv auf das Myelin-Basisprotein waren. Und von den verbleibenden Zellen wurden Dichtediagramme von Zellen erstellt, die für jedes Fluorochrom positiv waren.
Die Häufigkeit jeder neuronalen Zellpopulation wurde aus dem dritten Tor heraus berechnet. Proben, die mit manueller mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet wurden, ergaben eine wesentlich geringere Population von Zellen von Interesse, während sowohl frische als auch fixierte Proben, die mit automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss verarbeitet wurden, eine um ein Vielfaches höhere Population von Zellen von Interesse zeigten. Während die Perfusions- und Schmutzentfernungsschritte anfangs eine Herausforderung darstellen können, kann die Aufrechterhaltung einer glatten und ruhigen Hand dazu beitragen, den Erfolg sicherzustellen.
