소량의 신경 조직을 성공적으로 해리하면 실험실이 치료 효능, 세포 기능뿐만 아니라 질병 및 치료 작용 메커니즘에 대한 구조 별 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 신경 해리 프로토콜은 일관되게 매우 실행 가능하고 실제 단일 세포 현탁액을 산출합니다. 또한 상업용 키트가 의도 한 샘플의 일부에 불과한 샘플을 처리 할 수 있습니다.
적절한 계획과 준비는이 기술의 성공적인 결과의 열쇠입니다. 프로토콜에 익숙해지기 위해 여러 연습 라운드를 실행하는 것이 유익 할 것입니다. 6 개월 된 여성 C57BL / 6J 마우스를 마취 한 후 하복부를 꼬집고 포셉을 사용하여 피부를 들어 올립니다.
그런 다음 가위를 사용하여 모피와 피부를 흉곽 바닥으로 자릅니다. 흉곽 아래에서 시작하여 각 어깨쪽으로 움직이는 두 개의 대각선 절개를 만듭니다. 그런 다음 횡격막과 흉곽을 조심스럽게 절제하여 심장을 노출시킵니다.
심장 주위의 결합 조직을 조심스럽게 제거한 후 가위를 사용하여 오른쪽 심방을 클립하십시오. 그런 다음 호흡기로 이소플루란 흐름을 끕니다. 포셉으로 심장을 안정적으로 잡고 나비 바늘의 경사가 위를 향하게하여 바늘 수준을 유지하면서 동물과 평행하게 유지하면서 좌심실을 관통하십시오.
다음으로, 바늘을 제자리에 고정하고 펌프를 켜고 심장을 떠나는 액체가 불투명하고 간과 폐가 옅어질 때까지 적어도 30 밀리리터의 식염수 또는 헤파린 용액을 관류하십시오. 관류 후 펌프를 끄고 바늘을 제거한 다음 마우스를 해부 영역으로 옮깁니다. 목을 졸라 죽인 후, 머리 뒤쪽에서 눈까지 모피를 자르고 피부를 다시 벗겨 두개골을 노출시킵니다.
다음으로, 눈 사이에 두개골을 클립하고 10시와 2시 위치에 두개골 뒤쪽에서 두 번 자릅니다. 그런 다음 두개골의 중간 시상 선을 따라 눈 사이의 원래 컷까지 긴 컷을 하나 만듭니다. 다음으로, 포셉을 사용하여 두개골의 두 반쪽을 옆으로 떼어냅니다.
그런 다음 주걱을 사용하여 뇌를 제거하고 차가운 DPBS로 채워진 60 밀리미터 유리 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 보관하십시오. 메스 또는 면도기를 사용하여 각 반구를 분리하고 후각 전구와 소뇌를 제거하십시오. 그런 다음 해마가 노출 될 때까지 중뇌를 제거하십시오.
다음으로, 포셉으로 뇌를 고정하십시오. 그런 다음 두 번째 포셉 세트를 사용하여 각 반구에서 해마를 부드럽게 밟으십시오. 두 하마를 차가운 DPBS가 들어있는 라벨이 붙은 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
포셉을 사용하여 해마 조직 조각을 C 튜브로 옮기고 30 마이크로 리터의 효소 믹스 2를 튜브에 첨가하십시오. 뚜껑을 비틀고 딸깍 소리가 날 때까지 조인 후 튜브를 해리기에 넣고 적절한 프로그램을 실행하십시오. 프로그램이 실행되는 동안 두 밀리리터의 BSA 버퍼가있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 놓인 70 미크론 셀 스트레이너를 미리 적시십시오.
해리 프로그램이 완료된 후, 해리된 조직에 네 밀리리터의 BSA 버퍼를 첨가하고, 50밀리리터 원뿔형 튜브 상의 세포 스트레이너를 통해 혼합물을 여과한다. 다음으로 10 밀리리터의 DPBS를 C 튜브에 첨가하십시오. 그런 다음 튜브를 닫고 용액을 부드럽게 소용돌이 치며 50 밀리리터 원뿔형 튜브의 세포 스트레이너를 통해 여과하십시오.
여과된 세포 현탁액을 원심분리하고, 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 버리고 펠렛을 저장한다. 이물질 제거를 위해, 펠릿을 1, 550 마이크로리터의 차가운 DPBS로 재현탁시키고 현탁액을 라벨이 붙은 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴다. 그런 다음 450 마이크로 리터의 차가운 이물질 제거 용액과 피펫을 위아래로 첨가하십시오.
세포 현탁액을 한 밀리리터의 차가운 DPBS로 부드럽게 오버레이하여 팁을 원뿔형 튜브의 벽에 대고 유지합니다. 총 오버레이가 두 밀리리터가 될 때까지 절차를 반복하십시오. 다음으로, 현탁액을 3, 000 배 G에서 10 분 동안 원심 분리하여 완전 가속 및 완전 휴식.
맨 위 층을 흡인 한 다음 피펫 팁을 앞뒤로 스윕하여 흰색 중간 층을 흡인하십시오. 가장 아래쪽 레이어를 방해하지 않고 가능한 한 많은 중간 레이어를 제거하십시오. 다음으로, 두 밀리리터의 차가운 DPBS와 피펫을 위아래로 섞으십시오.
그런 다음 현탁액을 1, 000 배 G에서 10 분 동안 원심 분리하여 완전 가속 및 완전 휴식. 원심분리 후, 상청액을 버리고 펠렛을 하나의 밀리리터 BSA 완충액에 재현탁시킨다. 세포 카운팅 후, 남아있는 세포 현탁액을 원심분리하고, 펠렛을 희석된 50 마이크로리터의 살아있는 죽은 얼룩에 재현탁시킨다.
이어서, 샘플을 표지된 유동 튜브로 옮기고, 어둠 속에서 8 내지 10분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 500 마이크로리터의 BSA 완충액을 첨가하고 원심분리 단계를 반복한다. 그런 다음 상청액을 버리고 소량의 완충액을 튜브에 남겨 둡니다.
일차 게이트는 전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 파편을 배제하고 죽은 세포는 이후에 제외되었습니다. 두 번째 게이트는 미엘린 염기성 단백질에 대해 양성인 세포를 배제하였다. 나머지 세포 중에서, 각각의 형광색에 대해 양성인 세포의 밀도 플롯이 생성되었다.
각 신경 세포 집단의 빈도는 세 번째 게이트로부터 계산되었다. 수동 기계적 해리 및 효소 소화로 처리된 샘플은 실질적으로 더 낮은 관심 세포 집단을 산출한 반면, 자동화된 기계적 해리 및 효소 소화로 처리된 신선 및 고정 샘플 모두 관심 세포의 몇 배 더 높은 집단을 나타냈다. 관류 및 이물질 제거 단계는 처음에는 어려울 수 있지만 부드럽고 꾸준한 손을 유지하면 성공을 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
