少量の神経組織の解離に成功すれば、ラボは治療の有効性、細胞機能、疾患や治療の作用機序に関する構造特異的な洞察を得ることができます。この神経解離プロトコルは、一貫して、非常に生存可能で実際の単一細胞懸濁液をもたらす。さらに、市販のキットが意図しているもののほんの一部にすぎないサンプルを処理できます。
適切な計画と準備は、この手法を成功に導くための鍵です。プロトコルに慣れるためにいくつかの練習ラウンドを実行することは有益です。生後6ヶ月の雌性C57BL/6Jマウスに麻酔をかけた後、下腹部をつまみ、鉗子で皮膚を持ち上げます。
その後、はさみを使用して、毛皮と皮膚を胸郭の底に切り込みます。胸郭の下から始まり、各肩に向かって移動する2つの斜めの切開を行います。その後、横隔膜と胸郭を慎重に切除して心臓を露出させます。
心臓の周りの結合組織を慎重に取り除いた後、はさみを使って右心房をクリップします。その後、ブリーザーへのイソフルランの流れをオフにします。鉗子で心臓をしっかりと保持し、蝶の針の斜めを上に向けて、針を水平に保ちながら左心室を突き刺し、動物と平行にします。
次に、針を所定の位置に保持し、ポンプをオンにし、心臓を離れる流体が不透明になり、肝臓および肺の色が薄くなるまで、少なくとも30ミリリットルの生理食塩水またはヘパリン溶液を灌流する。灌流後、ポンプをオフにし、針を外し、マウスを解剖領域に移す。斬首後、頭の後ろから目まで毛皮を切り取り、皮膚を剥がして頭蓋骨を露出させます。
次に、頭蓋骨を目の間にクリップし、頭蓋骨の後ろに10時と2時の位置で2つの切り傷を作ります。次に、頭蓋骨の矢状線に沿って目の間の元の切り傷まで1つの長い切り傷を作ります。次に、鉗子を使用して、頭蓋骨の2つの半分を側面に剥がします。
その後、ヘラを使用して脳を取り除き、冷たいDPBSで満たされた60ミリメートルのガラスペトリ皿に入れ、氷の上に保ちます。メスまたはカミソリを使用して、各半球を分離し、嗅球と小脳を取り除きます。その後、海馬が露出するまで中脳を取り除きます。
次に、鉗子で脳を固定します。次に、2組目の鉗子を使用して、各半球から海馬を優しくいじめます。両方の海馬を冷たいDPBSを含むラベルの付いた1.5ミリリットルのチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。
鉗子を使用して、海馬組織片をCチューブに移し、30マイクロリットルの酵素ミックス2をチューブに加える。キャップをひねり、カチッと音がするまで締め付けた後、チューブを解離器に入れ、適切なプログラムを実行します。プログラムの実行中に、50ミリリットルの円錐形チューブの上に置かれた70ミクロンのセルストレーナーを2ミリリットルのBSAバッファーでプリウェットします。
解離プログラムが完了したら、解離した組織に4ミリリットルのBSAバッファーを加え、50ミリリットルの円錐管上の細胞ストレーナーを通して混合物をろ過する。次に、10ミリリットルのDPBSをCチューブに加えます。その後、チューブを閉じ、溶液を静かに旋回させ、50ミリリットルの円錐形チューブ上のセルストレーナーを通して濾過する。
濾過した細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を捨て、ペレットを保管する。破片を除去するには、ペレットを1,550マイクロリットルの冷たいDPBSで再懸濁し、懸濁液をラベル付き50ミリリットルの円錐形チューブに移す。次に、450マイクロリットルの冷たい破片除去溶液とピペットを上下に加えます。
細胞懸濁液を1ミリリットルの冷たいDPBSで静かに重ね合わせ、先端を円錐管の壁に保ちます。オーバーレイの合計が 2 ミリリットルになるまで、この手順を繰り返します。次に、懸濁液を3,000倍のGで10分間遠心分離し、完全な加速と完全なブレークを行います。
最上層を吸引し、ピペットチップを前後に掃引して白い中間層を吸引します。最下層の層を乱すことなく、中間層をできるだけ多く取り除きます。次に、2ミリリットルの冷たいDPBSとピペットを上下に追加して混合します。
その後、懸濁液を1,000倍のGで10分間遠心分離し、完全な加速と完全なブレークを行います。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルのBSA緩衝液に再懸濁する。細胞計数後、残りの細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを50マイクロリットルの希釈生死染色液に再懸濁する。
次いで、試料を標識されたフローチューブに移し、暗所で室温で8〜10分間インキュベートする。インキュベーション後、500マイクロリットルのBSAバッファーを加え、遠心分離工程を繰り返す。その後、上清を捨て、チューブに少量の緩衝液を残します。
一次ゲートは前方散乱対側散布図の破片を除外し、その後死細胞は除外した。第2のゲートは、ミエリン塩基性タンパク質に対して陽性の細胞を除外した。そして残りの細胞のうち、各蛍光色素に対して陽性の細胞の密度プロットが作成された。
各神経細胞集団の頻度は、第3ゲート外で計算した。手動機械的解離および酵素消化で処理されたサンプルは、目的の細胞集団が実質的に低かったのに対し、自動機械的解離および酵素消化で処理された新鮮および固定サンプルの両方が、目的の細胞集団の数倍高いことを示した。灌流と破片の除去手順は最初は困難な場合がありますが、滑らかで安定した手を維持することは成功を確実にするのに役立ちます。
