La dissociation réussie de petites quantités de tissus neuronaux peut permettre aux laboratoires d’obtenir des informations spécifiques à la structure sur l’efficacité du traitement, la fonction cellulaire, ainsi que sur les mécanismes d’action de la maladie et du traitement. Ce protocole de dissociation neuronale produit systématiquement une suspension unicellulaire très viable et réelle. De plus, nous pouvons traiter des échantillons qui ne représentent qu’une fraction de ceux auxquels les kits commerciaux sont destinés.
Une planification et une préparation appropriées sont essentielles à la réussite de cette technique. Il serait bénéfique d’effectuer plusieurs séances d’entraînement pour vous familiariser avec le protocole. Après avoir anesthésié une souris femelle C57BL/6J âgée de six mois, pincez le bas-ventre et soulevez la peau à l’aide d’une pince.
Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez à travers la fourrure et la peau jusqu’au bas de la cage thoracique. Faites deux incisions diagonales en commençant sous la cage thoracique et en se déplaçant vers chaque épaule. Ensuite, réséquez soigneusement le diaphragme et la cage thoracique pour exposer le cœur.
Après avoir soigneusement retiré tout tissu conjonctif autour du cœur, utilisez des ciseaux pour clipser l’oreillette droite. Ensuite, éteignez le flux d’isoflurane vers le respirateur. En maintenant le cœur stable avec une pince et avec le biseau de l’aiguille papillon tourné vers le haut, percez le ventricule gauche tout en gardant l’aiguille à niveau et parallèle à l’animal.
Ensuite, maintenez l’aiguille en place, allumez la pompe et perfuser au moins 30 millilitres de solution saline ou d’héparine jusqu’à ce que le liquide quittant le cœur soit opaque et que le foie et les poumons soient de couleur pâle. Après la perfusion, éteignez la pompe, retirez l’aiguille et transférez la souris dans la zone de dissection. Après la décapitation, coupez la fourrure de l’arrière de la tête jusqu’aux yeux et pelez la peau pour exposer le crâne.
Ensuite, coupez le crâne entre les yeux et faites deux coupes à l’arrière du crâne à 10 et 2 heures. Ensuite, faites une longue coupe le long de la ligne mi-saclastique du crâne jusqu’à la coupe d’origine entre les yeux. Ensuite, à l’aide d’une pince, pelez les deux moitiés du crâne sur les côtés.
Ensuite, utilisez une spatule pour retirer le cerveau et placez-le dans une boîte de Petri en verre de 60 millimètres remplie de DPBS froid et conservée sur de la glace. À l’aide d’un scalpel ou d’un rasoir, séparez chaque hémisphère et retirez les bulbes olfactifs et le cervelet. Retirez ensuite le mésencéphale jusqu’à ce que l’hippocampe soit exposé.
Ensuite, sécurisez le cerveau avec une pince. Ensuite, à l’aide d’une deuxième pince, taquinez doucement l’hippocampe hors de chaque hémisphère. Transférer les deux hippocampes dans un tube étiqueté de 1,5 millilitre contenant du DPBS froid et placer le tube sur de la glace.
À l’aide d’une pince, transférez les morceaux de tissu de l’hippocampe dans un tube C et ajoutez 30 microlitres de mélange d’enzymes 2 dans le tube. Après avoir tordu le capuchon et serré jusqu’à ce qu’il clique, placez le tube dans un dissociateur et exécutez le programme approprié. Pendant que le programme est en cours, pré-mouillez une passoire cellulaire de 70 microns placée sur un tube conique de 50 millilitres avec deux millilitres de tampon BSA.
Une fois le programme de dissociation terminé, ajoutez quatre millilitres de tampon BSA au tissu dissocié et filtrez le mélange à travers la passoire cellulaire sur le tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de DPBS au tube C. Ensuite, fermez le tube, faites tourbillonner doucement la solution et filtrez-la à travers la passoire cellulaire sur le tube conique de 50 millilitres.
Centrifugez la suspension de cellule filtrée, jetez le surnageant sans perturber la pastille et stockez la pastille. Pour l’enlèvement des débris, remettez en suspension la pastille avec 1 550 microlitres de DPBS froid et transférez la suspension dans un tube conique étiqueté de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 450 microlitres de solution d’élimination des débris à froid et pipette de haut en bas.
Superposez doucement la suspension cellulaire avec un millilitre de DPBS froid, en gardant la pointe contre la paroi du tube conique. Répétez la procédure jusqu’à ce que la superposition totale soit de deux millilitres. Ensuite, centrifugez la suspension à 3 000 fois G pendant 10 minutes avec une accélération complète et une pause complète.
Aspirer la couche supérieure, puis balayer la pointe de la pipette d’avant en arrière pour aspirer la couche intermédiaire blanche. Retirez autant que possible la couche intermédiaire sans perturber la couche inférieure. Ensuite, ajoutez deux millilitres de DPBS froid et pipette de haut en bas pour mélanger.
Ensuite, centrifugez la suspension à 1 000 fois G pendant 10 minutes avec une accélération complète et une pause complète. Après centrifugation, jeter le surnageant et remettre la pastille dans un tampon BSA millilitre. Après le comptage des cellules, centrifugez la suspension cellulaire restante et remettez en suspension la pastille dans 50 microlitres de teinture morte vivante diluée.
Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube d’écoulement étiqueté et incubez à température ambiante pendant 8 à 10 minutes dans l’obscurité. Après l’incubation, ajoutez 500 microlitres de tampon BSA et répétez l’étape de centrifugation. Ensuite, jetez le surnageant, en laissant une petite quantité de tampon dans le tube.
La porte primaire excluait les débris dans les nuages de dispersion avant par rapport aux nuages de dispersion latéraux et les cellules mortes ont ensuite été exclues. La deuxième porte excluait les cellules positives pour la protéine de base de la myéline. Et parmi les cellules restantes, des diagrammes de densité de cellules positives pour chaque fluorochrome ont été créés.
La fréquence de chaque population de cellules neuronales a été calculée à partir de la troisième porte. Les échantillons traités par dissociation mécanique manuelle et digestion enzymatique ont donné une population nettement inférieure de cellules d’intérêt, tandis que les échantillons frais et fixes traités avec dissociation mécanique automatisée et digestion enzymatique ont montré une population plusieurs fois plus élevée de cellules d’intérêt. Bien que les étapes de perfusion et d’élimination des débris puissent être difficiles au début, le maintien d’une main lisse et stable peut aider à assurer le succès.
