Dissociando com sucesso pequenas quantidades de tecido neural pode equipar laboratórios para obter uma visão específica da estrutura sobre a eficácia do tratamento, a função celular, bem como os mecanismos de ação de doenças e tratamentos. Este protocolo de dissociação neural consistentemente produz uma suspensão de célula única altamente viável e real. Além disso, podemos processar amostras que são apenas uma fração daquelas para as que os kits comerciais são destinados.
O planejamento e a preparação adequados são fundamentais para um resultado bem-sucedido para esta técnica. Executar várias rodadas de prática para se familiarizar com o protocolo seria benéfico. Depois de anestesiar um rato C57BL/6J fêmea de seis meses de idade, belisque o abdômen inferior e levante a pele usando fórceps.
Em seguida, usando uma tesoura, corte a pele e a pele até o fundo da caixa torácica. Faça duas incisões diagonais começando abaixo da caixa torácica e movendo-se em direção a cada ombro. Em seguida, ressecaça cuidadosamente o diafragma e a caixa torácica para expor o coração.
Depois de remover cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo ao redor do coração, use uma tesoura para cortar o átrio direito. Em seguida, desligue o fluxo isoflurane para o respirador. Segurando o coração firme com fórceps e com o bisbilhoteiro da agulha borboleta virado para cima, fure o ventrículo esquerdo mantendo o nível da agulha e paralelo ao animal.
Em seguida, segurando a agulha no lugar, ligue a bomba e peruse pelo menos 30 mililitros da solução salina ou heparina até que o fluido deixando o coração seja opaco e o fígado e pulmões pálidos em cores. Após a perfusão, desligue a bomba, remova a agulha e transfira o mouse para a área de dissecção. Após a decapitação, corte a pele da parte de trás da cabeça até os olhos e descasque a pele para trás para expor o crânio.
Em seguida, corte o crânio entre os olhos e faça dois cortes na parte de trás do crânio às posições das 10 e 2 horas. Em seguida, faça um corte longo ao longo da linha midsagittal do crânio para o corte original entre os olhos. Em seguida, usando fórceps, descasque as duas metades do crânio para os lados.
Em seguida, use uma espátula para remover o cérebro e colocá-lo em uma placa de vidro de 60 milímetros de Petri cheia de DPBS frio e mantida no gelo. Usando um bisturi ou navalha, separe cada hemisfério e remova as lâmpadas olfativas e o cerebelo. Em seguida, remova o cérebro médio até que o hipocampo seja exposto.
Em seguida, proteja o cérebro com fórceps. Em seguida, usando um segundo conjunto de fórceps, gentilmente provocar o hipocampo fora de cada hemisfério. Transfira ambos o hipocampi para um tubo de 1,5 mililitro rotulado contendo DPBS frio e coloque o tubo no gelo.
Usando fórceps, transfira os pedaços de tecido hipocampi para um tubo C e adicione 30 microliters de enzima mistura 2 no tubo. Depois de torcer a tampa e apertar até clicar, coloque o tubo em um dissociador e execute o programa apropriado. Enquanto o programa está em execução, pré-molhado um coador de células de 70 mícrons colocado em um tubo cônico de 50 mililitros com dois mililitros de tampão BSA.
Após o programa de dissociação ser concluído, adicione quatro mililitros de tampão BSA ao tecido dissociado e filtre a mistura através do coador celular no tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de DPBS ao tubo C. Em seguida, feche o tubo, gire a solução suavemente e filtre-a através do coador de células no tubo cônico de 50 mililitros.
Centrifugar a suspensão celular filtrada, descartar o sobrenatante sem perturbar a pelota e armazenar a pelota. Para a remoção dos detritos, resuspenja a pelota com 1.550 microliters de DPBS frios e transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros rotulados. Em seguida, adicione 450 microliters de solução de remoção de detritos frios e pipeta para cima e para baixo.
Sobreponha suavemente a suspensão celular com um mililitro de DPBS frio, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita o procedimento até que a sobreposição total seja de dois mililitros. Em seguida, centrifugar a suspensão a 3.000 vezes G por 10 minutos com aceleração total e quebra total.
Aspire a camada mais alta e, em seguida, varrer a ponta pipeta para frente e para trás para aspirar a camada média branca. Remova o máximo possível da camada média sem perturbar a camada mais baixa. Em seguida, adicione dois mililitros de DPBS frios e pipeta para cima e para baixo para misturar.
Em seguida, centrifufique a suspensão a 1.000 vezes G por 10 minutos com aceleração total e quebra total. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em um amortecedor BSA mililitro. Após a contagem de células, centrifugar a suspensão restante da célula e resuspensar a pelota em 50 microliters de mancha morta viva diluída.
Em seguida, transfira a amostra para um tubo de fluxo rotulado e incubar à temperatura ambiente por 8 a 10 minutos no escuro. Após a incubação, adicione 500 microliters de tampão BSA e repita a etapa de centrifugação. Em seguida, descarte o supernatante, deixando uma pequena quantidade de tampão no tubo.
O portão primário excluiu detritos na dispersão dianteira versus parcelas de dispersão lateral e as células mortas foram posteriormente excluídas. O segundo portão excluiu células positivas para a proteína básica da mielina. E das células remanescentes, foram criadas parcelas de densidade de células positivas para cada fluorocromo.
A frequência de cada população de células neuronais foi calculada a partir do terceiro portão. As amostras processadas com dissociação mecânica manual e digestão enzimática produziram uma população substancialmente menor de células de interesse, enquanto amostras frescas e fixas processadas com dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática mostraram uma população várias vezes maior de células de interesse. Embora as etapas de perfusão e remoção de detritos possam ser desafiadoras inicialmente, manter uma mão suave e firme pode ajudar a garantir o sucesso.
