Dissociare con successo piccole quantità di tessuto neurale può dotare i laboratori di ottenere informazioni specifiche sulla struttura sull'efficacia del trattamento, sulla funzione cellulare, nonché sui meccanismi d'azione della malattia e del trattamento. Questo protocollo di dissociazione neurale produce costantemente una sospensione monocellulare altamente praticabile ed effettiva. Inoltre, possiamo elaborare campioni che sono solo una frazione di quelli a cui sono destinati i kit commerciali.
Una corretta pianificazione e preparazione sono la chiave per un risultato di successo per questa tecnica. Eseguire diversi round di pratica per familiarizzare con il protocollo sarebbe utile. Dopo aver anestetizzato una femmina di topo C57BL / 6J di sei mesi, pizzicare l'addome inferiore e sollevare la pelle usando una pinza.
Quindi usando le forbici, tagliare la pelliccia e la pelle sul fondo della gabbia toracica. Fai due incisioni diagonali che iniziano sotto la gabbia toracica e si muovono verso ciascuna spalla. Quindi resecare con attenzione il diaframma e la gabbia toracica per esporre il cuore.
Dopo aver rimosso con cura qualsiasi tessuto connettivo intorno al cuore, utilizzare le forbici per agganciare l'atrio destro. Quindi spegnere il flusso di isoflurano allo sfiato. Tenendo il cuore fermo con una pinza e con la smussatura dell'ago della farfalla rivolta verso l'alto, perforare il ventricolo sinistro mantenendo l'ago a livello e parallelo all'animale.
Quindi, tenendo l'ago in posizione, accendere la pompa e perfondere almeno 30 millilitri della soluzione salina o di eparina fino a quando il fluido che lascia il cuore è opaco e il fegato e i polmoni di colore pallido. Dopo la perfusione, spegnere la pompa, rimuovere l'ago e trasferire il mouse nell'area di dissezione. Dopo la decapitazione, tagliare la pelliccia dalla parte posteriore della testa fino agli occhi e sbucciare la pelle per esporre il cranio.
Quindi, aggancia il cranio tra gli occhi e fai due tagli nella parte posteriore del cranio a ore 10 e 2. Quindi fai un taglio lungo lungo la linea medio-mediana del cranio fino al taglio originale tra gli occhi. Quindi, usando una pinza, stacca le due metà del cranio ai lati.
Quindi utilizzare una spatola per rimuovere il cervello e posizionarlo in una capsula di Petri di vetro da 60 millimetri riempita con DPBS freddo e tenuta sul ghiaccio. Usando un bisturi o un rasoio, separare ogni emisfero e rimuovere i bulbi olfattivi e il cervelletto. Quindi rimuovere il mesencefalo fino a quando l'ippocampo è esposto.
Quindi, proteggi il cervello con una pinza. Quindi, usando una seconda serie di pinze, stuzzicare delicatamente l'ippocampo da ciascun emisfero. Trasferire entrambi gli ippocampi in un tubo etichettato da 1,5 millilitri contenente DPBS freddo e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Usando la pinza, trasferire i pezzi di tessuto dell'ippocampo in un tubo C e aggiungere 30 microlitri di miscela enzimatica 2 nel tubo. Dopo aver ruotato il cappuccio e stretto fino a quando non scatta, posizionare il tubo in un dissociatore ed eseguire il programma appropriato. Mentre il programma è in esecuzione, pre-bagnare un filtro cellulare da 70 micron posto su un tubo conico da 50 millilitri con due millilitri di tampone BSA.
Al termine del programma di dissociazione, aggiungere quattro millilitri di tampone BSA al tessuto dissociato e filtrare la miscela attraverso il filtro cellulare sul tubo conico da 50 millilitri. Quindi, aggiungere 10 millilitri di DPBS al tubo C. Quindi chiudere il tubo, ruotare delicatamente la soluzione e filtrarla attraverso il filtro cellulare sul tubo conico da 50 millilitri.
Centrifugare la sospensione cellulare filtrata, scartare il surnatante senza disturbare il pellet e conservare il pellet. Per la rimozione dei detriti, risospesciare il pellet con 1.550 microlitri di DPBS freddo e trasferire la sospensione in un tubo conico da 50 millilitri etichettato. Quindi aggiungere 450 microlitri di soluzione di rimozione dei detriti freddi e pipetta su e giù.
Sovrapporre delicatamente la sospensione cellulare con un millilitro di DPBS freddo, mantenendo la punta contro la parete del tubo conico. Ripetere la procedura fino a quando la sovrapposizione totale è di due millilitri. Successivamente, centrifugare la sospensione a 3.000 volte G per 10 minuti con accelerazione completa e rottura completa.
Aspirare lo strato più alto, quindi spazzare la punta della pipetta avanti e indietro per aspirare lo strato intermedio bianco. Rimuovere il più possibile lo strato intermedio senza disturbare lo strato più in basso. Quindi, aggiungere due millilitri di DPBS freddo e pipetta su e giù per mescolare.
Quindi centrifugare la sospensione a 1.000 volte G per 10 minuti con accelerazione completa e rottura completa. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospese il pellet in un tampone BSA da un millilitro. Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare la sospensione cellulare rimanente e risospese il pellet in 50 microlitri di macchia morta viva diluita.
Quindi trasferire il campione in un tubo di flusso etichettato e incubare a temperatura ambiente per 8-10 minuti al buio. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di tampone BSA e ripetere la fase di centrifugazione. Quindi scartare il surnatante, lasciando una piccola quantità di tampone nel tubo.
Il cancello primario escludeva i detriti nei grafici a dispersione diretta rispetto ai grafici a dispersione laterale e le cellule morte venivano successivamente escluse. Il secondo gate escludeva le cellule positive per la proteina di base della mielina. E delle cellule rimanenti, sono stati creati grafici di densità di cellule positive per ogni fluorocromo.
La frequenza di ogni popolazione di cellule neuronali è stata calcolata dalla terza porta. I campioni elaborati con dissociazione meccanica manuale e digestione enzimatica hanno prodotto una popolazione sostanzialmente inferiore di cellule di interesse, mentre sia campioni freschi che fissi elaborati con dissociazione meccanica automatizzata e digestione enzimatica hanno mostrato una popolazione di cellule di interesse parecchie volte superiore. Mentre le fasi di perfusione e rimozione dei detriti possono essere inizialmente impegnative, mantenere una mano liscia e ferma può aiutare a garantire il successo.
