Diese Methode ist nützlich, um die zelluläre Energetik, wie die ATP-Produktionsrate, zu bestimmen und auch die zelluläre Präferenz für einen bestimmten Metaboliten in Echtzeit zu bestimmen. Fügen Sie zunächst 200 Mikroliter XF-Kalibrant hinzu und inkubieren Sie die Gebrauchsplatte mindestens eine Stunde lang vor dem Assay. Bereiten Sie 80 Milliliter XF-Assay-Medien mit ergänztem XF-DMEM vor.
Tauen Sie Oligomycin A, Rotenon und Antimycin A auf Eis auf. Pipettieren Sie die Verbindungen auf und ab, um sie vor dem Gebrauch zu lösen. Fügen Sie drei Milliliter vorbereitetes Assay-Medium zu jedem Röhrchen hinzu, das mit A und B gekennzeichnet ist.Geben Sie 26,4 Mikroliter 2,5 millimolar Oligomycin A in Röhrchen A und 3,1 Mikroliter 12,67 Millimolar Rotenon, 4,1 Mikroliter 9,4 Millimolar Antimycin A und 30 Mikroliter Hook's Fleck in Tube B.Laden Sie eine 10-fache Konzentration dieser Inhibitoren in den entsprechenden Injektionsport.
Und schließlich werden 20 Mikroliter dieser Verbindungen in 200 Mikroliter Assay-Medien in die Zellen geladen. Entfernen Sie die Zellkultur-Mikrotiterplatte aus dem 37 Grad Celsius Inkubator und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Assay-Medium aus dem Wasserbad.
Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem Assay-Medium zweimal und fügen Sie 200 Mikroliter Assay-Medien pro Well hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen an den Vertiefungen haften bleiben. Stellen Sie sicher, dass die Zellen in D5- und E8-Vertiefungen mit einer konsistenten Monoschicht verklebt sind und während des Waschschritts nicht weggespült wurden.
Die Zellbildgebungssoftware verwendet diese beiden Vertiefungen zum Einstellen des Autofokus und der automatischen Belichtung. Öffnen Sie die Desktop-Software im Computer neben dem Gerät. Überprüfen Sie den Verbindungsstatus in der unteren linken Ecke der Controller-Software.
Wechseln Sie zu Vorlagen und wählen Sie die XF ATP Rate Assay-Vorlage oder die entsprechende Assay-Vorlage aus. Wählen Sie oben auf dem Bildschirm Gruppendefinitionen und definieren Sie die Gruppen. Wählen Sie das Layout der Plattenkarte aus und weisen Sie die Bohrungen abhängig von den definierten Gruppen zu.
Überprüfen Sie das Geräteprotokoll. Stellen Sie sicher, dass die hinzugefügten Verbindungen korrekt aufgelistet sind, und fügen Sie die Projektinformationen für zukünftige Referenzen hinzu. Klicken Sie auf Test ausführen.
Dadurch wird die Auswahl des Speicherorts der Ergebnisdatei angezeigt. Wählen Sie den Speicherort für die Ergebnisdatei aus. Speichern Sie die Datei mit dem Assay-Datum und klicken Sie auf Start Run.
Legen Sie die Sensorkassette und die Gebrauchsplatte auf das Fach und klicken Sie auf Ich bin bereit, um die Kalibrierung zu starten. Öffnen Sie die Zellbildgebungssoftware auf dem Computer. Stellen Sie sicher, dass der Microplate-Imager eingeschaltet und die Anschlüsse an den Computer angeschlossen sind.
Überprüfen Sie die Statusleiste unten links auf dem Bildschirm, um sicherzustellen, dass die Temperatur auf 37 Grad Celsius eingestellt ist und dass der Verbindungsstatus grün als bereit hervorgehoben werden sollte. Scannen Sie den Platten-Barcode, um den Bildgebungsprozess zu starten. Geben Sie der Zellplatte einen Namen ein und klicken Sie auf Speichern.
Hellfeld- und Fluoreszenzbilder werden hier gespeichert. Klicken Sie auf Hellfeld-Scan durchführen und im nächsten Bildschirm zeigen Platte und Scan-Menü die Optionen für die Bildgebung an. Wählen Sie vor dem Assay Brightfield Scan starten aus.
Legen Sie die Zellkultur-Mikroplatte und die Plattenabdeckung auf den Tray-Halter und richten Sie A1 gut mit der A1-Markierung aus. Klicken Sie auf Fach schließen. Die Hellfeld-Bildaufnahme erscheint im nächsten Bildschirm mit einer Plattenkarte.
Klicken Sie auf Alle Vertiefungen scannen und scannen Sie für 30 bis 35 Minuten. Nach Abschluss der Kalibrierung zeigt die Software das Dialogfeld Wägezellenplatte an. Klicken Sie dann auf Open Tray, um das Utility-Tray durch eine Zellkultur-Mikrotiterplatte zu ersetzen.
Beachten Sie, dass sich die Zellkulturplatte im Mikroplatten-Imager befindet. Entfernen Sie nach dem Scan die Zellkultur-Mikrotiterplatte und legen Sie sie in den Analysator, um den Assay durchzuführen. Klicken Sie dann auf Wägezellenplatte, um den Assay zu starten.
Warten Sie, bis der Assay beginnt, und zeigen Sie die geschätzte Fertigstellungszeit an. Nach Abschluss des Assays zeigt die Software das Dialogfeld "Sensorkassette entladen" und "Cell Plate" an. Klicken Sie auf Auswerfen und entfernen Sie die Zellkultur-Mikrotiterplatte aus dem Analysator.
Entfernen Sie vorsichtig die Sensorpatrone und setzen Sie den Deckel der Zellenplatte wieder ein. Das Dialogfeld "Assay Complete" wird angezeigt. Klicken Sie dann auf Ergebnisse anzeigen, um die Assay-Ergebnisdatei zu öffnen oder die Daten zu normalisieren.
Scannen Sie nach Abschluss des Assays den Platten-Barcode mit dem tragbaren Barcode-Lesegerät. Wenn die Platte bereits abgebildet wurde, ist kein neuer Name erforderlich. Wählen Sie Fluoreszenz und Zellzahl.
Legen Sie die Zellenplatte auf den Trayhalter und klicken Sie auf Close Tray. Wählen Sie im Bildaufnahmefenster die Option Alle Vertiefungen scannen aus, um mit der Bildgebung zu beginnen. Überprüfen Sie die fluoreszierenden Bilder und Zellzahlen in der Bildgebungs- und Zellbildgebungsanwendung, indem Sie zufällig auf einige der Vertiefungen klicken.
Sobald die Fluoreszenzbildgebung abgeschlossen ist, exportieren Sie die Bilder für zusätzliche Referenzen. Sobald die Bildgebung und Zellzahl abgeschlossen ist, öffnen Sie die Ergebnisdatei und klicken Sie auf Normalisieren. Klicken Sie auf Importieren und wählen Sie Apply für die Desktop-Software, um den Assay mit der Zellzahl automatisch zu normalisieren.
Die Injektion von Oligomycin A und FCCP-Stressormischung erhöhte die Ausgangsaktivität der Kontrollgruppe. Stressoren zeigten ein signifikant hohes Energieniveau in der Kontroll- und Behandlungsgruppe. Auf der anderen Seite hatte Behandlung zwei eine vergleichsweise geringere Ausgangsaktivität, und die Zellen wurden aerober geworden.
Die Abbildung zeigt, dass sowohl Kontroll- als auch Versuchszellen Glykolyse und mitochondriale oxidative Phosphorylierung zur ATP-Erzeugung verwenden. Die experimentelle Gruppe zeigt eine Verringerung der ATP-Bildung durch Glykolyse und eine Erhöhung der mitochondrialen Atmung. Die basale Atmungsrate in der Behandlungsgruppe ist vergleichsweise geringer als in der Kontrollgruppe.
Die Atmungs- und ATP-Produktionsraten in beiden Gruppen sind verringert, zusammen mit dem Protonenleck, gefolgt von einer Oligomycin-A-Injektion. Die Atmungsraten der Zellen steigen nach der Injektion von FCCP wieder auf ihre maximale Atmung an. Die letzte Injektion von Rotenon und Antimycin A verringert die OCR wieder.
Nach der dritten Injektion wird die mitochondriale Atmung durch die Kombination von Rotenon und Antimycin A heruntergefahren.Im Vergleich zur Kontrollgruppe hat sich die basale und maximale Atmung der Behandlungsgruppen relativ unverändert. Die Abbildung zeigt, dass die Kontrollgruppe stark vom Glukoseweg abhängig ist, während die Glutaminoxidation in der Kontrollgruppe effizient war. Der Fettsäureweg zeigt, dass die Behandlung die Gesamtkapazität der Zellen erhöht hat.
Die Verfügbarkeit mehrerer Injektionsports auf der Säureplatte hilft uns, die Wirkung mehrerer Medikamente auf die zelluläre Energetik zu einem einzigen Zeitpunkt zu bestimmen.
