In diesem Experiment werden C2C12 Myoblasten Zellen bei einer gegebenen Dichte in Seahorse Zellkulturplatten ausgesät. Die basale Sauerstoffverbrauch (OCR) und extrazelluläre Ansäuerung (ECAR) Preise sind gemessen zu den Ausgangswerten Preise zu etablieren. 1. Cells Injection Die Zellen sind metabolisch gestört durch drei Zugänge verschiedener Verbindungen (in Folge), dass die bioenergetische Profil der Zelle zu verschieben. Eine Gruppe wird als Kontrollgruppe dienen, mit fließendem Medien als Kontrolle &quot;Verbindungen&quot; aufgenommen. <ol><li> Die erste Injektion ist Oligomycin. Oligomycin hemmt die ATP-Synthese durch die Blockierung der Protonen-Kanal der F o Teil ATP-Synthase (Komplex V). In mitochondrialen Forschung ist es zum Zustand 3 (Phosphorylierung) Atmung verhindern. Mit Zellen, kann es verwendet werden, um den Prozentsatz der O2-Verbrauch gewidmet ATP-Synthese und der Prozentsatz der O2-Verbrauch benötigt, um die natürlichen Proton Leck in der inneren Mitochondrienmembran überwinden zu unterscheiden. </li><li> Die zweite Injektion ist FCCP. FCCP (Carbonyl Cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) ist ein Ionophor, dass eine mobile Ionen-Träger ist. Es ist eine Entkopplung Agenten, weil es die ATP-Synthese gestört durch den Transport von Wasserstoff-Ionen über die Membran der Mitochondrien statt des Protons Kanal der ATP-Synthase (Komplex V). Dieser Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials führt zu einem schnellen Verbrauch von Energie und Sauerstoff ohne die Erzeugung von ATP. In diesem Fall wird sowohl OCR und ECAR erhöhen, OCR durch Entkopplung und ECAR wie die Zellen auf ihre Energiebilanz durch Glykolyse zu ATP zu erzeugen halten versuchen. FCCP Behandlung kann verwendet werden, um den &quot;Ersatz&quot; respiratory Kapazität von Zellen, die als die quantitative Unterschied zwischen maximaler unkontrollierte OCR und der anfänglichen basalen OCR definiert ist zu berechnen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Aufrechterhaltung der einige freie Atemwege Kapazität auch unter den Bedingungen der maximalen physiologischen oder pathophysiologischen Stimulus ein wichtiger Faktor der Definition der Vitalität und / oder das Überleben der Zellen ist. Die Fähigkeit von Zellen auf Stress unter den Bedingungen der erhöhten Energiebedarf reagieren, ist in einem großen Teil von der bioenergetischen Kapazität der Mitochondrien beeinflusst. Diese bioenergetischen Kapazität wird durch verschiedene Faktoren, einschließlich der Fähigkeit der Zelle an das Substrat zu Mitochondrien und die Funktionsfähigkeit der Enzyme in Elektronentransport beteiligt liefern-vermint abschrecken </li><li> In der dritten Injektion wird Rotenon, ein Komplex I-Inhibitor, zu den Zellen gegeben. Dies wird heruntergefahren mitochondriale Atmung und ermöglichen sowohl die mitochondriale und nicht-mitochondriale Fraktionen beitragen, um die Atmung zu berechnen. Man wird beobachten, eine Abnahme der OCR Folge gestörter Funktion der Mitochondrien, mit einem gleichzeitigen Anstieg der ECAR wie die Zelle verlagert, um eine glykolytischen Staat, um ihre Energiebilanz zu erhalten Rotenon ist ein mitochondrialen Inhibitor, der die Übertragung von Elektronen von der Fe-S-Zentrum in Komplex I zu Ubichinon (Coenzym Q) verhindert. Diese Hemmung der Komplex I verhindert, dass die potentielle Energie in NADH davon entfernt, in nutzbare Energie in Form von ATP umgewandelt. </li></ol> 2. Reagenzien und Materialien <ol><li> Oligomycin, FCCP und Rotenon Solutions (Seahorse Mito Stress Test Kit) </li><li> DMEM Laufen Media (Seahorse # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Destilliertes Wasser (Gibco 15230-170) </li><li> Calibration-Puffer (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. Wachstumsmedium <ol><li> 500 ml DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 mL Penn / Strep (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ml Natriumpyruvat (Sigma S8636) </li><li> 5 mL Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. Seeding-Protokoll <ol><li> Die Zellen werden in XF96 Zellkulturen Platten mit 10.000 Zellen / well in 100 ul Wachstumsmedium ausgesät und in 37 ° C-Inkubator mit 10% CO 2. </li><li> Cells wird den XF96 Zellkulturplatte innerhalb von 1 Stunde zu halten. </li><li> Assay-Zellen in XF96 24 Stunden nach der Aussaat. </li></ol> 5. Vorbereitung der Assay-Vorlage <ol><li> Mit dem Assay-Assistenten (Anhang I), erzeugen eine Vorlage mit der folgenden Gruppe Layout: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Nun Grid-Layout zu identifizieren Spalte und Gruppenzugehörigkeiten </li></ol> 6. Compound Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Verbindungen in XF DMEM Assay Medien wie folgt: 10 uM Oligomycin, 30,0 uM FCCP, 20,0 uM Rotenon, Diese Konzentrationen stellen die 10X Verdünnung vorgenommen, wenn die Verbindungen in den Brunnen eingespritzt wird. Die Arbeitsgruppe Konzentrationen sind: 1 uM Oligomycin, 3,0 uM FCCP, 2,0 uM Rotenone </li></ol> 7. Medien ändern und Cell Preparation <ol&gt; <li> Legen Sie die Zellplatte auf dem XF Prep Station </li><li> Stellen Sie die letzte Band des Mediums zu 160 ul pro Well. </li><li> Inkubieren in 37 ° C Inkubator ohne CO 2 für 60 Minuten, damit Zellen mit dem Assay-Medium pre-Gleichgewicht zu bringen. </li></ol> 8. Loading Sensor Cartridge <ol><li> Warm-Verbindungen auf 37 ° C vor dem Laden Fühlerpatrone und laden Sie die Verbindungen in den Injektor-Ports wie folgt: <ol><li> Spalten 1-4: Laden 16, 18, und 20 ul des XF Assay Medien (DMEM) in den Anschlüssen A, B und C sind. </li><li> Spalten 5-12: Lade 16 ul der Oligomycin in Häfen A Last 18 ul der FCCP in Häfen B Legen Sie 20 uL Rotenon in Häfen C </li></ol></li></ol> 9. Protokoll-Befehle <table border="1"><tbody><tr><td> Befehl </td><td> Zeit (min) </td><td> Port </td></tr><tr><td> Kalibrieren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Äquilibrieren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Ende </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Protocol-Befehle

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers und David A. Ferrick sind Mitarbeiter von Seahorse Bioscience, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel vorgestellten produziert.

Dieser Assay ist von der klassischen Experiment, um die Funktion der Mitochondrien-Sonde abgeleitet und dient als Rahmen, mit denen bis zu komplexeren Experimenten an Verständnis verschiedene Veränderungen im Zellstoffwechsel, die Funktion der Mitochondrien, und die allgemeine Bioenergetik Ziel zu bauen. Alle Verbindungen in diesem Experiment verwendet werden, sollten für die Konzentration, die maximale Wirkung stellt optimiert werden. Das heißt, man muss getrennte Titration Experimente durchführen, um diese Werte zu ermitteln. Dies ist besonders wichtig mit FCCP, wie die Titrationskurve neigt dazu, ziemlich scharf, und zu viel FCCP kann tatsächlich abnehmen Reaktionen in OCR. Typische Bereiche (Endkonzentrationen) zu testen wäre: <ul><li> 0,1 bis 1,0 ug / ml Oligomycin </li><li> 0,1 bis 5,0 uM FCCP </li><li> 0,1 bis 1,0 uM Rotenone </li></ul> Beachten Sie, dass die Antworten auf jede Verbindung über (vor allem FCCP) von der Assay-Media-Komposition (Basistyp, [Glukose], [Pyruvat], Anwesenheit / Abwesenheit von BSA, usw.) beeinflusst wird. Ferner, wenn die XF-Assay Medien Zusammensetzung geändert wird, wird die Optimierung müssen neu durchgeführt werden. Das Vorhandensein und die Konzentration von Pyruvat ist besonders wichtig bei der Erlangung der maximalen Lungenkapazität durch FCCP. Seahorse Bioscience hat in einer Reihe von Zelllinien beobachtet, dass Unterlassung von Pyruvat die Fähigkeit der Zellen auf maximal reagieren (über dem Ausgangswert) auf FCCP hebt. In der Regel sollte die Konzentration von 1-10 mM Pyruvat getestet, um die optimale Konzentration von Pyruvat zu verstehen, um eine maximale Atmung zu erhalten. Beachten Sie, dass [Pyruvat] UND [Glukose] muss möglicherweise &quot;cross-Titration&quot;, die optimal media Bedingungen für das Experiment zu erhalten. Typische Ergebnisse dieses Experiments sind unten in ein Diagramm, das OCR-Zeit und eine andere Darstellung ECAR gegen die Zeit dargestellt: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. OCR gegen die Zeit <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. ECAR gegen die Zeit Hier beobachteten wir die erwarteten Antworten in OCR und ECAR wie die Zellen mit jeder Verbindung behandelt werden. Für Oligomycin, OCR als Folge der Blockierung der ATP-Synthese in Mitochondrien Complex V. Da die Zellen nicht in der Lage ATP über OXPHOS synthetisieren, sie Glykolyse zurückgreifen, um ihre Forderung nach ATP erfüllen abnimmt, so beobachten wir eine Zunahme in ECAR. Wie zuvor gezeigt, wirkt FCCP als Entkopplung Agenten. Da die Zellen nun überwunden werden muss das Proton Leck über die innere Membran der Mitochondrien erhöht OCR signifikant mehr O2 verbraucht wird, um die überschüssige Protonen wieder Pumpe über den mitochondrialen Membran. Schließlich hemmt Rotenon mitochondrialen Komplex I und Komplex III verbunden, die bewirkt, dass der Fluss der Elektronen in der Elektronen-Transportkette einzustellen und damit den Verbrauch von O2 wird drastisch reduziert. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Respiration Parameter Über die zu erwartenden Veränderungen in Atmung und ECAR, kann eine Reihe von respiratorischen Parameter aus diesen Daten gewonnen werden. Dies ist in der obigen Abbildung zusammengefasst: Hier sehen wir, dass wir Informationen über die basale Atmung der Zellen, der prozentuale Anteil der O2-Verbrauch gewidmet ATP-Produktion sowie die Höhe gewidmet Aufrechterhaltung des Protonengradienten (durch H + Leck) zu erhalten. Ferner können wir die maximale Atemfrequenz unter den Bedingungen der entkoppelten Atmung (manchmal auch als Ersatz Atemkapazität genannt) zu erhalten und schließlich können wir die Menge der O2-Verbrauch nicht durch mitochondriale Prozesse zu bestimmen. Eine rasch wachsende Zahl von Studien beschäftigen diese mitochondriale Profil zellulären Bioenergetik bewerten, mitochondriale Dysfunktion und die Fähigkeit von Zellen, um Stress und / oder Beleidigungen reagieren vorherzusagen. Für weitere Informationen und Details zu diesem experimentellen Methode und die Idee der freien Atemkapazität finden Sie beziehen sich auf die folgenden Veröffentlichungen 1-8.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

Die Fähigkeit, den Zellstoffwechsel zu messen und zu verstehen, mitochondriale Dysfunktion, hat Wissenschaftler aus aller Welt ihre Forschungsergebnisse zum Verständnis der Rolle der mitochondrialen Funktion in Fettleibigkeit, Diabetes, Alterung, Krebs, Herz-Kreislauf-Funktion und Sicherheit Toxizität vorab aktiviert. Der Zellstoffwechsel wird der Prozess der Substrat-Aufnahme, wie Sauerstoff, Glukose, Fettsäuren und Glutamin, und der anschließenden energetischen Umwandlung durch eine Reihe von enzymatisch gesteuerten Oxidations-und Reduktions-Reaktionen. Diese intrazellulären biochemischen Reaktionen führen in der Produktion von ATP, der Freisetzung von Wärme und chemische Nebenprodukte, wie Laktat und CO 2 in die extrazelluläre Umgebung. Der Sauerstoffverbrauch Rate - - oder OCR wertvolle Einblicke in den physiologischen Zustand der Zellen und die Veränderung des Status dieser Zellen kann durch Messung der Geschwindigkeit der Sauerstoff durch die Zellen, ein Indikator für die mitochondriale Atmung verbraucht gewonnen werden. Cells auch erzeugen ATP durch Glykolyse, dh: die Umwandlung von Glukose zu Laktat, unabhängig von Sauerstoff. In kultivierten Brunnen, wird Laktat die primäre Quelle von Protonen. Die Messung der Milchsäure indirekt über Protonen in den extrazellulären die Zellen umgebende Medium freigesetzt, die Ansäuerung des Mediums bietet die Extra-Cellular Ansäuerungsrate Ursachen hervorgerufen - oder ECAR. In diesem Experiment werden C2C12 Myoblasten Zellen bei einer gegebenen Dichte in Seahorse Zellkulturplatten ausgesät. Die basale Sauerstoffverbrauch (OCR) und extrazelluläre Ansäuerung (ECAR) Preise sind gemessen zu den Ausgangswerten Preise zu etablieren. Die Zellen werden dann metabolisch gestört durch drei Zugänge verschiedener Verbindungen (in Folge), dass die bioenergetische Profil der Zelle zu verschieben. Dieser Assay ist von einem klassischen Experiment, um zu beurteilen Mitochondrien abgeleitet und dient als Rahmen, mit denen komplexere Experimente an Verständnis sowohl physiologische und pathophysiologische Funktion der Mitochondrien Ziel zu bauen und auf die Fähigkeit von Zellen, um Stress und / oder Beleidigungen reagieren vorherzusagen.

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Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Eine Beschreibung eines Verfahrens zur Profilierung die Funktion der Mitochondrien in den Zellen ist. Die Mitochondrien-Profil generiert bietet vier Parameter der mitochondrialen Funktion, die in einem Experiment gemessen werden kann: basale Atemfrequenz, ATP-linked Atmung, Proton auslaufen und Reservekapazität.

Bioenergetische Profil Experiment mit C2C12 Myoblasten Cells

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K Aufrufe.  Novato, CA. Eine Beschreibung eines Verfahrens zur Profilierung die Funktion der Mitochondrien in den Zellen ist. Die Mitochondrien-Profil generiert bietet vier Parameter der mitochondrialen Funktion, die in einem Experiment gemessen werden kann: basale Atemfrequenz, ATP-linked Atmung, Proton auslaufen und Reservekapazität.

Serie: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Testen Nikotin Toleranz in Blattläuse mit einer künstlichen Diät Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Forschung

Biologie

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Morris Water Maze-Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...