Wir haben eine Plattformtechnologie für SARS COVID 2 etabliert, die auf andere Viren mit Spike-vermittelter Zellerkennung und -eintritt als erster Schritt bei zellulären Virusinfektionen anwendbar ist. Quantenpunkte sind hell, stabil und ihre Oberfläche kann für eine Vielzahl von zellulären Anwendungen funktionalisiert werden. Mit dieser Methode können wir die Spike-Internalisierung in Zellen visualisieren und messen.
Zur Vorbereitung von 0,1% BSA. Fügen Sie 130 Mikroliter 7,5% BSA zu 10 Millilitern Bildgebungsmedien im Mix hinzu. Für eine 6,1 bis drei serielle Verdünnung und dreifache fügen Sie 14,26 Mikroliter QD Spike zu 285,74 Mikrolitern der 0,1% BSA hinzu, um die höchste Konzentration von 20 Nanomol zu erhalten.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter von 20 Nanomol oder QD Spike zu 200 Mikrolitern von 0,1% BSA hinzu, um die zweite Wahnvorstellung von 6,67 Nanomol QD Spike zu machen. Entfernen Sie alle verbrauchten Medien aus jedem Vertiefungsfeld mit einem Mehrkanal-Aspirator, waschen Sie einmal mit einer Mehrkanalpipette mit 100 Mikrolitern Bildgebungsmedien pro Vertiefung und saugen Sie dann 100 Mikroliter der Bildgebungsmedien ab. Fügen Sie 50 Mikroliter QD Spike-Lösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Bereiten Sie mit Schutzausrüstung 4% PFA- und 0,1% PSA-Bildgebungsmedien in einer sterilen Biosicherheitskabine vor, saugen Sie 50 Mikroliter QD Spike aus jedem Bohrloch und fügen Sie 100 Mikroliter 4% PFA pro Bohrung mit einer automatisierten Mehrkanalpipette hinzu, um eine Trocknung der Bohrlöcher zu vermeiden. Inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur, waschen Sie dann dreimal mit PBS, bereiten Sie den tiefroten Kernfarbstoff vor, indem Sie die Fünf-Millimeter-Stammlösung bei einem bis 1000 in PBS verdünnen, saugen Sie das PBS ab und fügen Sie 50 Mikroliter verdünnten Kernfarbstoff pro Vertiefung wieder hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann dreimal mit PBS waschen, die Platte abbilden oder mit einem Plattenversiegeler für die spätere Bildgebung versiegeln.
Lagern Sie den Teller bei vier Grad Celsius. Starten Sie die Software für die Imaging-Plattform. Nachdem Sie sich bei der Bildgebungsplattform angemeldet haben, erstellen Sie ein neues Erfassungsprotokoll, indem Sie den Plattentyp als 96-wandige transparente Bodenabbildungsplatte auswählen, den optischen Modus als 40-faches Eintauchen in das Wasser auswählen, den optischen Modus als 40-faches Eintauchen in Wasser auswählen.
Wählen Sie den Modus für digitale Gesichtskontraste wie hohen Kontrast, um gut definierte Zellkörper zu erzeugen. Machen Sie einen Schnappschuss, um zu bestätigen, dass diese Überschrift im Bildfenster angezeigt wird, und wählen Sie den passenden C-Kanal für die Verwendung mit der ACE2-GFP-Zelllinie, um den ACE2-Verkehr innerhalb der Zelle zu visualisieren. Um einen benutzerdefinierten QD-Kanal zu erstellen, wählen Sie das Dreiecks-Dropdown-Menü und wählen Sie die Anregung im 405-Nanometer-Bereich in der Emission im 608-Nanometer-Bereich, wählen Sie einen Brunnen mit einem robusten zytoplasmatischen QD-Signal, um die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Z-Höhenposition einzustellen.
Überprüfen Sie, ob die Standardhöhe ein Bild der Zellen in der gewünschten Fokusebene erzeugt. Die Z-Position ist für die Endozytosepuncta niedriger als die Z-Position für die Plasmamembran. Wählen Sie eine Belichtungszeit, typischerweise zwischen 100 und 300 Millisekunden, die ein helles Bild mit Graustufen erzeugt, die mindestens dreimal so hoch sind wie das Hintergrundsignal.
Bei 20 Nanomol sollten die Graustufen etwa 6.000 Atomeinheiten mit 200 Millisekunden Belichtungszeit und 80% Laserleistung betragen. Überprüfen Sie die Graustufen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken, das mit der Schnappschussfunktion in jedem Kanal erzeugt wird, und die Show-Intensität auswählen, dann mit der linken Maustaste auf das Objekt von Interesse oder den Hintergrund klicken, um den Graustufen für dieses Pixel anzuzeigen, und passen Sie die Laserleistung an, um die Intensität der Objekte von Interesse zu optimieren. Speichern Sie das Erfassungsprotokoll, wechseln Sie zum Ausführen des Experiments, geben Sie den Plattennamen ein, führen Sie das Experiment aus.
Die Translokation von QDs und ACE2 wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und einer ACE2-GFP-exprimierenden Zelllinie visualisiert. Die Bildsegmentierung und die anschließende Analyse wurden durchgeführt, um relevante Parameter wie die Spotanzahl zu extrahieren. Zuerst wurden Kerne aus dem Kernmarkerkanal segmentiert, um eine ROI-Population zu erzeugen.
Dann ein ROI-Bereich, der die Zelle mit Segmentierung unter Verwendung des ACE2-GFP-Kanals umreißt. Schließlich wurden QD 608 Spike-Spots aus der Zell-ROI-Region segmentiert, internalisierte QD- und ACE2-Signale zeigten eine starke Co-Lokalisierung. Ein Konzentrationsantwortexperiment mit sechs verschiedenen Konzentrationen von QD Spike wurde in HEK 293T-Zellen durchgeführt.
Bei der Bestimmung der optischen Konzentrationen von QD kann QDS so niedrig wie 2,22 Nanomol verwendet werden, es wird jedoch empfohlen, Konzentrationen von 10 Nanomol oder höher zu verwenden, um eine robuste Reaktion zu gewährleisten. Während der Konjugation zur QD-Proteinaggregation kann es zu einer Aggregation kommen. Aggregate wurden in der QD-Lösung als hell verklumpte Ausfällungen und HEK 293T-Zellen entdeckt, QDs wurden mit neutralisierten Antikörpern ab 30 Mikrogramm pro Mikroliter vor der Zugabe zu Zellen inkubiert, diese Antikörper blockierten die Bindungsinternalisierung und verursachten eine Verringerung der Spotanzahl im Vergleich zu Zellen, die nur mit QD behandelt wurden.
Dieser Aufsatz kann auch für das Hochdurchsatz-Screening verwendet werden, um die Bewertung neutralisierender Antikörper zu leiten, um antivirale Mittel zum Viruseintritt zu identifizieren und an die Untersuchung neu auftretender Varianten angepasst zu werden.
