Unsere Kombination aus Lasermikrodissektion und Massenspektrometrie ermöglicht die Untersuchung von räumlich aufgelösten Veränderungen auf proteomischer Ebene in jeder Art von Gewebe. In unserem Fall Neuromelanin-Granula. Unser Protokoll ermöglicht die proteomische Analyse basierend auf begrenztem Probenmaterial.
Das ist in der Regel eine große Herausforderung bei der Arbeit mit postmortalem Hirngewebe. Da einzelne Zellen isoliert werden können, um gesunde und Krankheitszustände auf proteomischer Ebene zu vergleichen. Dies kann unser Verständnis von Krankheitsmechanismen verbessern.
Legen Sie zunächst den Gewebemembranobjektträger mit dem Gewebe nach oben in den Objektträgerhalter auf der Robo-Bühne. Um einen Übersichtsscan des Gewebeschnitts zu erhalten. Verwenden Sie die Scan-Funktion, wählen Sie den Interessenbereich oben links und unten rechts aus.
Wählen Sie dann Alle ROIs scannen aus, um den Scan durchzuführen. Zur automatischen Auswahl von Neuromelanin-Granulaten im aktuellen Sichtfeld. Wählen Sie die Sichtfeldanalyse.
Wählen Sie dann Ergebnis umkehren und legen Sie den Schwellenwert für die RGB-Kanäle fest. So werden im Vorschaufenster nur Neuromelanin-Granulate rot hervorgehoben. Klicken Sie nun auf OK, um die angepassten Einstellungen für das Sichtfeld zu verwenden.
Passen Sie die Lasereinstellungen mit einem Bereich des Objektträgers an, der nur von der Membran bedeckt ist. Füllen Sie die Probenentnahmeröhrchenkappe mit 50 Mikrolitern Reinstwasser. Und stecken Sie die Kappe in den Kollektor des Robo Movers.
Positionieren Sie den Robo Mover über der zweiten Robo-Stufe, um die Probenentnahme zu starten. Starten Sie den Laser. Steuern Sie die Energie- und Fokuseinstellungen während des Laserprozesses und passen Sie die Einstellungen bei Bedarf an.
Stellen Sie sicher, dass die isolierten Objekte für mindestens die ersten 10 Objekte ordnungsgemäß isoliert und in die Probenentnahmeröhrchenkappe katapultiert werden. Wenn die Probenahme abgeschlossen ist, navigieren Sie den Robo Mover zu seiner Ausgangsposition und entfernen Sie das Probenentnahmeröhrchen. Nach dem Spinnen der Proben durch Zentrierung.
Trocknen Sie die Proben 1,5 Stunden lang in einem Vakuumkonzentrator. Nach Durchführung der triptischen Verdauung wie im Text beschrieben. Bereiten Sie die Probe für die HPLC-MS-Analyse vor, indem Sie 200 bis 400 Nanogramm Probenpeptide in einem definierten Volumen von 0,1% TFA auflösen.
In inerten massenspektrometrischen Glasfläschcheneinlässen. Wenn die Konzentrationsbestimmung aufgrund einer geringen Probenmenge nicht anwendbar ist. Überprüfen Sie die identische Probenbelastung durch Vergleich des gesamten Ionenstroms.
Um mit der proteomischen Rohdatenanalyse zu beginnen. Klicken Sie auf Laden, um die Rohdateien in die Software zu laden. Klicken Sie auf Set Experiment, um die Beispielnamen zuzuweisen.
Um gruppenspezifische Parameter zu definieren. Fügen Sie die Modifikationen hinzu, indem Sie Deamidierungs-NQ, Oxidation M und Carbamidomethylierungs-N-term als variable Modifikationen auswählen. und fügen Sie dann Carbamidomethylierung C als feste Modifikation hinzu.
Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym in der Verdauungsregisterkarte. Fügen Sie auf der Registerkarte labelfreie Quantifizierung die Option LFQ hinzu, und wenn mehr als 10 Dateien verarbeitet werden sollen, wählen Sie die Option schnelle LFQ, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen. Sicherstellen, dass alle anderen gruppenspezifischen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben.
Fahren Sie mit der Registerkarte globale Parameter fort und fügen Sie die von uniprot abgeleitete FASTA-Datei hinzu. org auf der Registerkarte Sequenzen. Ändern Sie die Bezeichnerregel entsprechend.
Und fügen Sie die Taxonomie-ID 9606 für Homo sapiens hinzu. Für die Proteinquantifizierung wählen Sie einzigartige und Rasiermesserpeptide. Fügen Sie dann die iBAQ-Option als Maß für die Proteinquantifizierung auf der Registerkarte "Label-freie Quantifizierung" hinzu.
Stellen Sie sicher, dass alle anderen globalen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben und klicken Sie auf Start. Nachdem die Analyse erfolgreich durchgeführt wurde, rufen Sie die Proteingruppen ab. TXT-Ausgabe.
Laden Sie die Proteingruppen. TXT-Datei in der Analysesoftware. Fügen Sie die iBAQ-Werte als Hauptspalten hinzu und sortieren Sie alle anderen Spalten nach ihrem Typ.
Filtern Sie Lockvögel und Verunreinigungen heraus, indem Sie Zeilen basierend auf der kategorialen Spalte filtern und Ergebnisse basierend auf gültigen Werten filtern. Exportieren Sie die Ausgabe zur weiteren Verarbeitung in das txt-Format. Und bewerten Sie die Ergebnisse bezüglich der Forschungsfrage.
In der vorliegenden Studie wurden 1.898 Proteingruppen in NMGs und 1.565 in umgebendem SN-Gewebe identifiziert, von denen 1.384 in beiden Gewebebereichen identifiziert wurden. So wurden 514 bzw. 181 Proteingruppen ausschließlich in NMGs bzw. SN-Gewebe identifiziert. In den repräsentativen DDA-Messungen.
Etwas höhere iBAQ-Werte in NMGs im Vergleich zu SN deuteten auf eine höhere Häufigkeit des Proteins zytoplasmatischen Dynien-1, der schweren Kette 1 in NMGs hin. Diese Beobachtung konnte in PRM-Experimenten für das Peptid ESPEVLLTLDILK bestätigt werden. In dem eine höhere Häufigkeit in NMGs nachgewiesen wurde.
Basierend auf der Spitzenfläche auf MS1- und MS2-Ebene. Der mit Abstand wichtigste Schritt ist die Isolierung der NMGs, da der Rest des Protokolls auf diesem Schritt basiert, um ordnungsgemäß durchgeführt zu werden. Nach dem LMD-Verfahren können die Proben für jede Art von Omics-Technik wie Genomik, Transkriptomik, Proteomik oder Lipidomik verwendet und weiterverarbeitet werden.
