Dieses Protokoll ist bedeutsam, da es eine zeitspezifische, gezielte Manipulation der Mausplazenten mittels CRISPR ermöglicht. Dies wird es den Forschern ermöglichen, bestimmte Genfunktionen während der mittleren bis späten Schwangerschaft aufzuklären. Genetische Manipulationen, die zu einer Überexpression in der Plazenta der Maus führen, sind sehr selten.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Reihe von Genexpressionsänderungen innerhalb der Plazenta ermöglicht. Lassen Sie sich nicht entmutigen, wenn vorläufige Bedingungen mit dieser Technik nicht erfolgreich sind. Da diese Technik eine Herausforderung ist, erfordert sie einige Zeit zum Üben, um sie zu beherrschen.
Platzieren Sie zunächst den betäubten Damm in Rückenlage mit einem Nasenkegel zur Aufrechterhaltung der Anästhesie im Präparationsbereich. Rasieren Sie den Bauch des Damms gründlich. Um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, tragen Sie künstliches Tränengel auf beide Augen des Damms auf.
Verwenden Sie dann sterile Applikatoren mit Wattespitze, um die Operationsstelle mit mindestens drei abwechselnden Runden einer Povidon-Jod-Lösung zu desinfizieren, gefolgt von 70%igem Ethanol mit einer letzten Schicht Povidon-Jod-Lösung. Bewegen Sie nach der Vorbereitung den Damm mit dem Anästhesienasenkegel in den dafür vorgesehenen Operationsbereich. Für die Uterus-Laparotomie legen Sie die Mutterkiefer in Rückenlage auf den Operationstisch und fixieren Sie den Nasenkegel mit Klebeband.
Legen Sie ein Heizkissen unter ein saugfähiges Pad, das auf 45 Grad Celsius eingestellt ist. Nachdem Sie die Anästhesietiefe durch das Fehlen eines Zehenquetschrefluxes bestätigt haben, machen Sie mit Pinzette und Schere einen etwa zwei Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie durch die aufgeklebte Haut. Machen Sie dann mit einer sterilen Pinzette einen vertikalen Schnitt durch das Bauchfell, der vorsichtig von den Gebärmutterhörnern entfernt ist.
Massieren Sie beide Gebärmutterhörner, indem Sie mit den Fingern auf beide Seiten des Bauches drücken, um sie zu führen. Legen Sie die freiliegende Gebärmutter auf sterile chirurgische Abdeckungen, die über den Unterbauch gelegt werden, und halten Sie sie bei Bedarf mit Tropfen warmer, steriler Kochsalzlösung feucht. Sobald die Gebärmutter freigelegt ist, wählen Sie drei Plazentapaare zur Manipulation aus.
Zeichnen Sie die Lokalisation der Plazentamanipulationen und die Organisation der Embryonen in den Gebärmutterhörnern auf. Für die plazentare Injektion des Kontrollplasmids wird eine ausreichende Menge des entsprechenden Kontrollplasmids für drei Injektionen mit einer kalibrierten Mikropipette geladen. Führen Sie alle Injektionen zwischen der Dezidua und der Verbindungszone in einer Tiefe von ca. 0,5 Millimetern seitlich in die Plazenta durch.
Nach der Injektion, aber unmittelbar vor der Elektroporation, beschichten Sie die Kontaktstellen mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette oder Spritze genau auf die drei Stellen der Gebärmutterwand und der Paddel auf. Führen Sie innerhalb von zwei Minuten nach der Injektion die Elektroporation mit einem Paar Drei-Millimeter-Paddel durch, die an einer Elektroporationsmaschine befestigt sind. Um die Effizienz der CRISPR-Inkorporation und die Lebensfähigkeit von Embryonen zu gewährleisten, stellen Sie die Einstellungen auf 30 Volt, 30-Millisekunden-Puls, zwei Pulse, 970-Millisekunden-Puls aus und unipolar ein.
Drücken Sie die Elektroporationspaddel sanft über die Gebärmutterwände an den seitlichen Seiten der Plazenta. Platzieren Sie das Anodenpaddel über der Injektionsstelle und die Kathode direkt gegenüber. Drücken Sie den Impuls auf der Elektroporationsmaschine und warten Sie, bis die beiden Impulse abgeschlossen sind, bevor Sie die Elektroporationspaddel entfernen.
Fahren Sie dann mit der Plazentainjektion des experimentellen Plasmids fort, wie zuvor gezeigt. Führen Sie die Elektroporation aller drei experimentell injizierten Plazenten innerhalb von zwei Minuten nach der Injektion durch, wie sie für die Kontrollgruppe durchgeführt wurde. Sobald die Plazentamanipulation abgeschlossen ist, massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft zurück in die Bauchhöhle, indem Sie nur mit den Fingern die Gebärmutterhörner direkt manipulieren.
Führen Sie unterbrochene Nähte auf der Bauchfellschicht mit 45 Zentimeter langen, beschichteten und geflochtenen auflösbaren Nähten mit einer 13-Millimeter-Dreiachtel-Kreisnadellegierung durch. Nachdem Sie die Peritoneumschicht vernäht haben, vernähen Sie die Haut mit auflösbaren Nähten, wobei Sie die gleiche Art von auflösbaren Nähten verwenden, die für das Peritoneum verwendet werden. Sobald die Naht abgeschlossen ist, tragen Sie Gewebekleber auf die Nähte auf der Haut auf.
Wenn der Gewebekleber getrocknet ist, schalten Sie den Verdampfer aus und übertragen Sie den Damm aus dem Operationsbereich in einen stützenden Käfig auf seinem Rücken. Plazenten wurden mit einem allgemeinen CRISPR-Cas9-Kontrollplasmid und einem Aktivierungskontroll-CRISPR-Plasmid oder einem IGF-1-SAM-Aktivierungsplasmid injiziert. Die repräsentativen Bilder nach der Nekropsie zeigten in keiner der Behandlungsgruppen eine auffällige Schädigung oder Veränderung des phänotypischen Erscheinungsbildes.
Die Überlebensrate der unbehandelten Embryonen in manipulierten Würfen sank auf durchschnittlich 79,05 %, während die Überlebensrate der manipulierten Embryonen mit durchschnittlich 55,56 % signifikant abnahm. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Gewichtszunahme der Mutter unmittelbar nach der Operation im Vergleich zu Scheinoperationen. Viele trächtige Muttertiere zeigten am Tag nach dem Eingriff eine leichte Gewichtsabnahme oder keine Gewichtsveränderung, was wahrscheinlich auf eine gestörte Nahrungsaufnahme während und kurz nach der Operation zurückzuführen ist.
Die meisten Muttertiere zeigten ein erhöhtes Gewicht auf E14.5, aber gelegentlich wurde immer noch eine Gewichtsabnahme beobachtet. Die qPCR zeigte einen signifikanten Anstieg der IGF-1-Expression in den IGF-1-Überexpressionsplazenten im Vergleich zu den Kontrollplazenten. Die ELIZA Bewertung der E14.5-Plazenten zeigte einen signifikanten Anstieg der IGF-1-Proteinspiegel in den IGF-1-Überexpressionsplazenten im Vergleich zu den Kontrollplazenten.
Die grüne Autofluoreszenz zeigte die Subregionen der plazentaren mütterlichen fetalen Schnittstelle mit roter Cas9-Markierung nur in der IGF-1-Überexpressionsplazenta, was auf eine erfolgreiche CRISPR-Inkorporation in allen drei Subregionen der Plazenta hinweist. Die Fluoreszenz-in-C2-Hybridisierungsmarkierung bestätigte den Einbau des IGF-1-Aktivierungsplasmids ohne Migration in unbehandelte Plazenten. Die Dezidual- und Labyrinthzone konnte identifiziert werden, die die durch Prl8a8-Färbung markierte rote Junctionalzone umgibt.
Denken Sie daran, die Art der Manipulation und die Lage der Plazenta und der entsprechenden Embryonen aufzuzeichnen. Es wird dringend empfohlen, die Lage des Gebärmutterhalses und der Embryonen in den Gebärmutterhörnern aufzuzeichnen. Nach diesem Verfahren kann eine Analyse der Plazenta, des Embryos und des Muttertiers durchgeführt werden.
Dies wird ein besseres Verständnis der plazentaspezifischen Rolle von Genen in der Schwangerschaft, der Plazentafunktion und der Embryonalentwicklung ermöglichen.
