Dieses Protokoll beschreibt eine potenziell neuartige therapeutische Strategie, die leicht für menschliche Anwendungen modifiziert werden kann. Diese Technik verbessert direkt die Induktion von Darm-Homing-regulatorischen T-Zellen in peripheren Lymphgeweben und kann auch in hochgradig pro-inflammatorischen Umgebungen stabil umgesetzt werden. Diese Techniken können auch verwendet werden, um die Rolle von aktivem Vitamin D und Vitamin A innerhalb des peripheren Immunsystems zu untersuchen.
Diese visuelle Demonstration wird Schritt für Schritt Anweisungen für die Erzeugung von hochwertigen technischen dendritischen Zellen bereitstellen, die für den Erfolg dieser Technik entscheidend sind. Beginnen Sie mit der Aussaat von 1 mal 10 zu den sieben 293T-Zellen in 20 MillilitercmCM-10-D-Zellkulturmedium in 150 mal 25 Millimeter Kulturplatten für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag 1,62 Milliliter frisch zubereitete zweifach konzentrierte HBS-Lösung, 9,5 Mikrogramm Hüllwasserid, 17,5 Mikrogramm Verpackungsplasmid und 27 Mikrogramm des LENTI-CYP-ALDH-Plasmids zu einem 50 Milliliter konischen Rohr hinzufügen.
Bringen Sie das Endvolumen des Rohrgehalts auf 3,0375 Milliliter mit Wasser, gefolgt von der Zugabe von 202,5 Mikrolitern von zwei Molcalciumchlorid tropfenweise. Lassen Sie die DNA-Niederschlagsmischung bei Raumtemperatur 20 Minuten bei gelegentlichem Mischen, bevor Sie 3,24 Milliliter der Lösung tropfenweise pro 293T-Kultur hinzufügen, während sie die Schale sanft wirbeln. Legen Sie die Platten 24 Stunden in den Inkubator, bevor Sie jede Platte vorsichtig mit PBS waschen und die Zellen mit CM-4-D-Kulturmedium füttern.
Nach weiteren 24 Stunden Kultur ernten Sie die Überstande in sterile Flaschen zur Lagerung bei vier bis acht Grad Celsius und füttern die Zellen für weitere 24 Stunden mit frischem CM-4-D-Medium. Am vierten Tag die Überstände wieder ernten und die Überstände von beiden Tagen drei und vier bis zu einem 0,45 Mikrometer Filter belasten. Konzentrieren Sie dann das Pseudotyp-Virus VSV-G 24 Stunden lang durch Zentrifugation.
Am nächsten Tag dekantieren die Überstande. Lassen Sie die Rohre auf einem Papiertuch in einem sterilen Bio-Sicherheitsschrank für mehrere Minuten abtropfen lassen, und setzen Sie dann die Pellets in 33,3 Mikroliter nsterilem PBS mit 5% Glycerin pro Kulturschale wieder auf. Für die knochenmarkabgeleitete dendritische Zellerzeugung, legen Sie die Tibias und Oberschenkelknochen, geerntet von BALB/c Mäusen, in ein 100 mal 20 Millimeter Kulturgericht mit frischem Kulturmedium.
Verwenden Sie sezierende Schere und Zange, um Gewebe aus den Knochen zu entfernen. Wenn alle Knochen gereinigt wurden, verwenden Sie die Schere, um beide Enden jedes Knochens zu schneiden, um die Knochenmarkhöhlen freizulegen. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 30-Meter-Nadel, um jeden Knochen mit 10 Milliliter frischem Kulturmedium zu spülen und das Knochenmark in einem 15-Milliliter-Rohr zu sammeln.
Wenn das gesamte Knochenmark gesammelt wurde, sedimentieren Sie das Knochenmark durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter roter Blutkörperchen Lysepuffer wieder auf. Nach vier bis fünf Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliterzellkulturmedium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter CM-10-R-Kulturmedium für das Zählen wieder auf und passen Sie die Zellen für ein mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter CM-10-R-Kulturmediumkonzentration an.
Als nächstes fügen Sie 100 Einheiten pro Milliliter rekombinantes murinen GM-CSF und 10 Einheiten pro Milliliter IL-4 zu den Zellen hinzu. Vier Milliliter Zellen für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 48 Stunden in einzelne Brunnen einer sechs Brunnenkulturplatte geben. Am Ende der Inkubation die nicht haftenden Zellen sanft ansaugen.
Fügen Sie frisches Medium, das mit GM-CSF und IL-4 ergänzt wird, zu den Kulturen hinzu, bevor Sie die Zellen für eine Zusätzliche 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Am Ende der zweiten Inkubation ernten Sie das nicht anhaftende Knochenmark, das dendritische Zellen für ihre Zentrifugation in 50 Milliliter Konustube gewonnen hat. Um BMDC-CYP-ALDH-Zellen zu erzeugen, setzen Sie die Kulturen ein mal zehn bis sechs literarisch pro 500 Mikroliter CM-10-R-Medium pro Brunnenkonzentration wieder aus und verdichten Sie 500 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer neuen sechs Brunnenkulturplatte.
Fügen Sie 50 Mikroliter des LENTI-CYP-ALDH-Virus und 8 Mikrogramm pro Milliliter Protamin zu jedem Brunnen hinzu, dann legen Sie die Platte 24 Stunden lang in den Inkubator. Am nächsten Tag die Überstande durch frisches Kulturmedium ersetzen und die Platten für weitere 24 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Am Ende der zweiten Inkubation können die Zellen 24 Stunden vor der Ernte für funktionelle Analysen mit 100 Nanogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid pro Brunnen aktiviert werden.
Im Vergleich zu den dendritischen Zellen des elterlichen Knochenmarks zeigen BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine verbesserte Expression von 1-Alpha-Hydroxylase. Die Konzentrationen der aktiven Form von Vitamin D in den Kulturüberobnatten von BMDC-CYP- und BMDC-CYP-ALDH-Zellen sind etwa 20-mal höher als die konzentrationen, die in dendritischen Zellunden des elternknochenmarks und der BMDC-ALDH-Zellkulturen beobachtet wurden. Die mittleren fluoreszierenden Intensitäten von BMDC-CYP-ALDH-Zellen, die mit dem Substrat behandelt werden, sind etwa sechsmal höher als die von zahngebundenen Knochenmarkabgeleiteten dendritischen Zellen, die mit dem Substrat behandelt werden.
Dies deutet darauf hin, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine signifikant verbesserte retinale Dehydhydrogenase-2-Enzymaktivität ausdrücken. DC2.4-Zellen, die mit 25-Hydroxy-Vitamin D und Netzhaut behandelt werden, induzieren keine signifikante Veränderung in der Fülle von foxp3-positiven CCR9-positiven CD4-positiven T-Zellen. Im Gegensatz dazu induzieren DC2.4 CYP-ALDH-Zellen, die mit 25-Hydroxy-Vitamin D und Netzhaut behandelt werden, signifikant höhere Anzahl von Darmhoming-regulatorischen T-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise.
Darüber hinaus induzieren DC CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu intraperitoneal injizierten Kontrollzellen auch eine signifikante Zunahme der Anzahl der foxp3-positiven CD4-positiven CD4-positiven T-Zellen nach intraperitonealer Injektion in BALB/c-Empfängertiere. Der Erfolg des Verfahrens hängt von der Herstellung gesunder T-Zellen und einer korrekt vorbereiteten DNA-Mischung ab.
