Gewebefibrose ist die primäre Art und Weise, dass Organe im Laufe der Zeit versagen, als Reaktion auf chronische Entzündungen oder Alterung. Und in der Tat würde ich argumentieren, dass, wenn Sie nicht an einem Infektier oder Krebs sterben, Werden Sie wahrscheinlich an Organfibrose sterben, wenn Sie älter werden. Leider gibt es nicht viele großartige Mausmodelle, um menschliche Gewebefibrose nachzuahmen.
Was wir also entwickelt haben, ist ein Mausmodell der Morbus Crohn, das ist eine Krankheit beim Menschen, die Fibrose des Darms verursacht und weitgehend unbehandelt ist. In der Tat, der einzige Weg, wie Sie es behandeln können, ist durch chirurgische Entfernung des fibrotischen Gewebes und Religation des Darms. Der Vorteil unseres Modells ist, dass es in allen Mausstämmen vollständig durchdringend ist und sehr eng die Krankheit des menschlichen Crohn imitiert und die Fibrose über einen Monat anhält, was wirklich ein robustes Modell ist.
Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist der Umgang mit den Mäusen und vor allem die orale Gavage, da dies eine Menge Praxis spezielle Zertifizierung erfordert. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal durchführen, sollte man sich bewusst sein, dass die Arbeit mit Salmonellen angemessene Sicherheitsvorkehrungen und sterile Technik erfordert. Die Entsorgung von Abfällen und Bakterien sollte vor dem Experiment geplant werden.
Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist sehr wichtig, da es den Umgang mit Salmonellen beinhaltet, die besondere Sicherheitsvorkehrungen sowie eine ordnungsgemäße sterile Technik erfordert. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine Platte mit LB-Agar mit Streptomycin in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter. Mit einer sterilen Impfschleife, streifen Sie die Platte mit einem gefrorenen Glycerin-Vorrat von S typhimurium Delta Pfeil a.
Über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Streifenplatten können bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche gelagert werden. Einen Tag vor der Infektion, lösen Sie 0,5 Gramm Streptomycin in 2,5 Milliliter Wasser, um das Antibiotikum vorzubereiten.
Filter sterilisieren die Streptomycin-Lösung. Verwenden Sie dann eine mit einer Glühbirne gekippte 22-Spur-Gavage-Nadel mit einer Ein-Milliliter-Spritze, um die Mäuse mit 100 Mikrolitern der Streptomycin-Lösung oral zu verklauen. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter LB-Brühe mit Streptomycin in einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter in eine Kulturröhre.
Mit einer Impfschleife impfen Sie die LB-Brühe mit einer einzigen Kolonie. Inkubieren Sie die Kultur aerob über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 Umdrehungen/ Minute. Führen Sie am Tag der Infektion zwei aufeinander folgende ein bis zehn Verdünnungen der über Nacht Salmonellenkulturen mit sterilem PBS durch, um die endgültige Infektionsdosis vorzubereiten.
Daraus ergibt sich ein 100-Mikroliter-Inokulum, das etwa drei Millionen koloniebildende Einheiten enthält. Danach verwenden Sie eine mit einer Glühbirne gekippte 22-Spur-Gavage-Nadel mit einer Milliliter-Spritze, um jede Maus mit 100 Mikrolitern der vorbereiteten Salmonellen zu verkleben. Legen Sie zunächst zwei Milliliter sicher-Schloss-Rundboden-Mikroröhren fest, fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter sterilen PBS und eine autoklavierte Edelstahlperle hinzu.
Vorwiegen der Schläuche vor der Gewebesammlung. Nach der Einschläfung von Mäusen, resektieren ihre Cecal und MilzGewebe, sicherstellen, gewebe von einzelnen Tieren in separate Röhren zu sammeln. Wiegen Sie jedes Rohr, um die Gewebegewichte zu bestimmen.
Verwenden Sie ein Mischermühlengerät, um das Gewebe bei 30 Hertz für 15 Minuten zu homogenisieren. Dann übertragen Sie 900 Mikroliter PBS in jeden Brunnen eines 96-Well-Zwei-Milliliter-Megablocks. Pipette 100 Mikroliter Gewebe homogeniert in den ersten Brunnen, und gut mischen.
Führen Sie serielle Verdünnungen durch Zugabe von 100 Mikrolitern zu nachfolgenden Brunnen durch, bis eine 10 zur negativen sechsten Verdünnung erhalten ist. Platte 10 Mikroliter jeder Verdünnung in Triplicaten auf LB-Agar, der Streptomycin enthält. Zählen Sie dann die durchschnittlichen koloniebildenden Einheiten und bestimmen Sie die koloniebildenden Einheiten pro Gramm Gewebe, wie im Textprotokoll beschrieben.
Öffnen Sie Fidschi, eine Open-Source-Imaging-Software und ziehen und legen Sie die tif-Bilddatei auf die Werkzeugleiste. Wählen Sie in der Menüleiste Bild, Typ, RGB-Stack aus, um das Bild in rote, grüne und blaue Kanäle aufzuteilen. Schieben Sie die horizontale Leiste am unteren Rand des Bedienfelds, um den Kanal auf grün einzustellen.
Öffnen Sie Bild, Anpassen, Schwellenwert Werkzeug. Passen Sie die minimalen und maximalen Grenzwerte an, um Hintergrundsignale zu eliminieren. Sobald der gewünschte Schwellenwert festgelegt ist, schließen Sie das Schwellenwertwerkzeug und gehen Sie zu Analysieren, Messen festlegen, Flächen auschecken, Flächenfraktion, Grenzwert auf Schwellenwert und Anzeigebeschriftung anzeigen.
Holen Sie sich die Gewebeauswahl mit dem Freihandauswahl- oder Polygonauswahlwerkzeug und messen Sie den prozentualen Bereich positiv für Kollagen, indem Sie auf Analysieren, Messen klicken. Dann normalisieren Sie den absoluten Bereich positiv für Kollagenfärbung zu Gewebebereich. Streptomycin Behandlung gefolgt von oralen Infektion mit S typhimurium Delta Pfeil a führt zu robusten Darmentzündungen und Fibrose, vor allem im Cecum.
Typische Krankheitslasten von 100 Millionen bis einer Milliarde Kolonien bildenden Einheiten können pro Gramm Cecum von infizierten Tieren zurückgewonnen werden, während 10 Tausend Koloniebildeinheiten in der Regel pro Gramm Milz zurückgewonnen werden können. Die Beurteilung der Fibrose in picrosirius rot gefärbten Cecal-Abschnitten zeigt Spitzenfibrose 21 Tage nach der Infektion, während ein Großteil der Pathologie durch Tag 42 nach der Infektion gelöst wird. Eine gründliche Vorbereitung der Materialien ist unerlässlich, da dieses Experiment mehrere Tage für die Einrichtung benötigt.
Die Herstellung von LB-Platten und Salmonellen und Streptomycin sollte alle aseptisch erfolgen. Stellen Sie vor dem Experiment sicher, dass der Experimentator mit dem Tierprotokoll sowie mit Sicherheitsrisiken vertraut ist. Bei der Bewertung der Kollagenbelastung kann der Experimentator andere biologische Assays durchführen, wie z. B. RNA-Sequenzierung zur Bewertung von Genexpressionsprofilen oder Durchflusszytometrie zur Beurteilung von Immunzellteilmengen oder einem Gewebe-ELISA zur Beurteilung von Zytokinprofilen.
So ist unser Modell besonders gut bei der Nachahmung einer menschlichen Krankheit namens Morbus Crohn, wo Sie Fibrose des Darms bekommen, die weitgehend unbehandelt ist und die einzige Möglichkeit, es zu behandeln ist, einen Abschnitt des Darms zu entfernen und es wieder zusammen zu nähen und hoffen, dass es nicht zurückkommt. Unser Modell ist sehr robust und wir haben bereits gezeigt, dass das Targeting angeborener lymphatischer Zellen Typ 3, ein Transkriptionsfaktor namens rohe Alpha, oder Interleukin 17 die Krankheit lindert und die Fibrose verhindert. Unser Modell ist besonders gut bei der Identifizierung der Faktoren, die bei der Pathogenese der Morbus Crohn und Darmfibrose spielen, und wir sind bereits auf dem Weg, eine Reihe von Zielen zu identifizieren, die therapeutisch behandelt werden könnten, um entzündliche Darmerkrankungen zu lindern.
Unser Modell hat bereits den gleichen ILC3 oder Alpha NIL17 Zugang kann bei anderen fibrotischen Erkrankungen im Spiel sein und dies gehören Dinge wie Psoriasis, Multiple Sklerose, idiopathische Lungenfibrose. Es ist also möglich, dass die Ausrichtung auf dieselben Faktoren auch bei diesen Krankheiten die Fibrose lindern könnte. Obwohl der mutierte Salmonellenstrom nicht virulent ist, ist es wichtig, die standarden Biogefahren-Sicherheitsprotokolle der Anlage zu befolgen.
Da Formaldehyddämpfe bekanntermaßen krebserregend sind, ist es wichtig, während des Fixierungsschritts hinter einer Dunstabzugshaube zu arbeiten.
