Dieses Protokoll bietet eine einfache Strategie zur Erstellung zellkultureller Modelle von weißen und braunen Adipozyten, die die Physiologie des Fettgewebes, die wir in vivo haben, in vitro originalgetreu rekapitulieren. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von weißen und braunen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen und die Zellen, die wir mit dieser Methode isolieren, bewerten eine hohe proliferative Kapazität und ein hohes Differenzierungspotenzial. Zellen, die mit diesem Ansatz isoliert wurden, spiegeln die Komplexität von Fettgewebe besser wider als andere Kulturmodelle.
Und es kann verwendet werden, um die Adipozytenfunktion bei Fettleibigkeit und Diabetes genauer zu untersuchen. Wir konzentrieren uns in erster Linie auf das Verständnis von Fettgewebedysfunktion bei Fettleibigkeit. Mit dieser Methode hergestellte Zellen können aber auch genutzt werden, um grundlegende Fragen über Zellen in der Entwicklungsbiologie zu untersuchen.
Der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment ist die Bestimmung, wie die weißen Fettdepots als diese Depots identifiziert werden können, die klein, aber sehr reich sind und proliferierende Präadipozyten bei Welpen schwer zu unterscheiden sind. Die visuelle Demonstration veranschaulicht, wie einfach dieses Protokoll ist und ermöglicht die Bereitstellung von Tipps zum Auffinden und Sezieren der weißen und braunen Fettdepots. Die Isolierung des Depots zu sehen, ist sehr hilfreich.
Um subkutanes weißes Fettgewebe zu sammeln, schneiden Sie die Haut um den Bauch eines eingeschläferten neugeborenen Welpen und ziehen Sie die Haut sanft unter die Beine. Ohne Hautgewebe zu sammeln, ernten Sie vorsichtig das Fettdepot, das als klares oder weißes, dünnes längliches Gewebe erscheint, das an der Innenseite der Haut oder auf dem Quadrizeps befestigt ist. Spülen Sie das geerntete Depot in PBS und legen Sie das Fettgewebe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 250 Mikrolitern PBS und 200 Mikrolitern 2X Isolationspuffer auf Eis.
Um interskapuläres braunes Fettgewebe zu sammeln, ziehen Sie die Haut von den Schulterblättern über den Kopf und heben Sie das tiefrotbraune Fettgewebe zwischen den Schulterblättern an. Machen Sie vorsichtig Einschnitte rund um die Fette, um sie vom Körper zu lösen und das Gewebe auf Konsistenz und Farbe zu überprüfen. Nach dem Spülen legen Sie das Gewebe in ein zweites 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 250 Mikrolitern PBS und 200 Mikrolitern 2X Isolationspuffer auf Eis.
Wenn alle Depots gesammelt sind, verwenden Sie eine Schere, um jedes Depot vier- bis sechsmal direkt in den Röhrchen vorsichtig zu zerhacken und fügen Sie jedem Röhrchen 50 Mikroliter 10X Kollagenase in 2X Isolationspuffer hinzu. Dann kehren Sie die Röhrchen schnell um, um das Gewebe zu mischen und legen Sie es für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 1400 Umdrehungen pro Minute in einen temperaturgesteuerten Mischer. Legen Sie am Ende der Verdauung die Schläuche wieder auf Eis und filtern Sie das Verdauungsgewebe durch 100-Mikron-Zellsieb in neue 50-Milliliter-Röhrchen.
Um die Zellausbeute zu maximieren, spülen Sie jedes Röhrchen mit einem Milliliter Isolationsmedium aus und filtern Sie dieses Wasser durch das Sieb. Verdünnen Sie die braunen und weißen Fettgewebelösungen auf zwei Milliliter Gewebesuspension pro Vertiefung und Depot in frischem Isolationsmedium. Dann zwei Milliliter weiße Fettgewebesuspension zu jeweils vier bis sechs Vertiefungen und zwei Milliliter braune Fettgewebesuspension zu jeweils zwei bis drei Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte durch einen 100-Mikron-Filter pro Vertiefung.
Wenn alle Zellen plattiert sind, legen Sie die Platte für 60 bis 90 Minuten in den Zellkulturinkubator. Am Ende der Inkubation jeden gut mit zwei Millilitern serumfreiem Medium waschen und die Platte vorsichtig rühren, um alle Blutzellen vom Boden der Vertiefungen zu lösen. Nach drei Wäschen zwei Milliliter frisches Isolationsmedium in die Vertiefungen geben und die Platte in den Zellkulturinkubator zurückgeben.
Wenn die Zellen 80 bis 90% Konfluenz erreichen, beschichten Sie neue Zielplatten mit steriler 0,1% Gelatine in destilliertem Wasser bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Während die Platten inkubieren, waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie sie drei Minuten lang im Zellkulturinkubator mit Trypsin behandeln. Wenn sich die Zellen gelöst haben, pipetten Sie die Zellsuspension mehrmals, um die Zellerholung zu maximieren und die Zellen in ein neues Röhrchen zu übertragen.
Wenn alle Zellen gesammelt sind, waschen Sie jede gut mit einem Milliliter Isolationsmedium und ziehen Sie die Waschungen mit der Zellsuspension. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in drei bis fünf Milliliter Isolationsmedium zum Zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf die geeignete Konzentration für die Beschichtung in frischem Isolationsmedium und waschen Sie die mit Gelatine beschichteten Platten mit PBS, um überschüssige Gelatine zu entfernen.
Dann säen Sie die Zellen auf die gelatinebeschichteten Platten und bringen die Zellen in den Zellkulturinkubator zurück. Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Isolationsmedium durch das Differenzierungsmedium. Wenn Sie braune Fettgewebe-Präadipozyten unterscheiden, fügen Sie auch ein nanomolares Trijodthyronin hinzu.
Nach 48 Stunden erfrischen Sie das Medium mit dem entsprechenden Wartungsmedium pro Kultur. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Ansammlung von kleinen Flüssigkeitströpfchen in den Zellen unter Hellfeldmikroskopie sichtbar werden. Auch nach dem Filtern verbleiben einige Zelltrümmer und Blutzellen in der Zellsuspension.
Sanftes Waschen eine Stunde nach dem Plattieren entfernt nicht relevante Zellen, da sich die Präadipozyten schnell am Boden des Brunnens anlagern. Obwohl sowohl weiße als auch braune Präadipozyten, die aus neugeborenen Welpen isoliert wurden, eine hohe proliferative Kapazität haben, ist die Ausbeute an weißen Präadipozyten im Allgemeinen doppelt so hoch wie die von braunen Präadipozyten pro Depotbasis. Wenn also synchronisierte Kulturen gewünscht werden, muss diese Startdichte der weißen Präadipozyten entsprechend berechnet werden.
Am Ende der Differenzierung scheinen die Zellen mit Lipidtröpfchen beladen zu sein und exprimieren klassische Marker von weißen bzw. braunen Adipozyten. In dieser vergleichenden Analyse des Sauerstoffverbrauchs in einem mitochondrialen Stresstest von primären weißen und braunen Adipozyten unter basalen Bedingungen sowie als Reaktion auf bekannte Stimulatoren der mitochondrialen Funktion können diese spezifischen bioenergetischen Fähigkeiten jedes Zelltyps beobachtet werden. Denken Sie daran, dass wir lebende Zellen isolieren und dass wir sie für mehrere Tage kulturieren wollen.
Achten Sie also darauf, während der Isolierung sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, um eine Kontamination zu vermeiden, die die nachfolgende Kultur beeinträchtigen kann. Diese Methode erzeugt vollständig ausgereifte Adipozyten, die für verschiedene Anwendungen verwendet werden können, einschließlich funktioneller Assays, genetischer oder chemischer Screens oder Omics-Profiling, um zellautonome Mechanismen zu untersuchen, die die Funktion der Adipozyten beeinflussen.
