Unser Organoidmodell ist sehr wertvoll, um die Biologie der Hypophysenstammzellen sowohl bei homöostatischen als auch bei Hypophysenumbauzuständen zu erforschen, wie z. B. bei der neonatalen Reifung der Drüse, dem alterungsbedingten funktionellen Rückgang und dem Tumorwachstum in der Drüse. Bis heute ist unsere Hypophysen-Organoid-Technik das einzige verfügbare Werkzeug, um primäre Hypophysenstammzellen der Maus zuverlässig und robust zu züchten und zu erweitern. Das Verfahren werden Emma Laporte und Charlotte Nys, Doktorandinnen in meiner Forschungsgruppe, demonstrieren.
Waschen Sie zunächst den Mauskopf mit deionisiertem Wasser, um das Blut zu entfernen. Sprühen Sie 70% Ethanol auf den Kopf, um eine sterile Umgebung zu erzeugen. Entfernen Sie dann die Haut zwischen den Ohren mit sterilen chirurgischen Werkzeugen.
Um den Schädel zu öffnen, brechen Sie den Nasenrücken mit einer sterilen Schere. Öffnen Sie den Schädel weiter ausgehend vom Nasenrücken zu den Ohren auf beiden Seiten. Entfernen Sie den Schädel und das Gehirn mit einer sterilen Pinzette, ohne die Hypophyse zu berühren.
Entfernen Sie das Zwerchfell sellae mit einer stumpfen Pinzette. Trennen Sie dann unter einem Stereomikroskop den vorderen Lappen vom hinteren und mittleren Lappen. Isolieren Sie den vorderen Lappen vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette und sammeln Sie ihn in einem 10-Milliliter-Erlenmeyerkolben, der drei Milliliter Medium A enthält.Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmte 2,5%ige Trypsinlösung hinzu.
Bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmte DNAse-Lösung hinzu und schwenken Sie den Erlenmeyerkolben 10 Mal. Lassen Sie die Hypophyse auf den Boden sinken und entfernen Sie den Überstand.
Fügen Sie zwei Milliliter vorerwärmte Trypsin-Inhibitor-Lösung hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand, wenn die Hypophyse auf den Boden sinkt. Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Medium B hinzu und inkubieren Sie für fünf Minuten.
Dazu zwei Milliliter vorgewärmtes Medium C geben und 15 Minuten inkubieren. Lassen Sie die Hypophyse auf den Boden sinken und entfernen Sie den Überstand. Dann spülen Sie es dreimal mit vorerwärmtem Medium C ab.Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Medium C.Aspirate hinzu und stoßen Sie die Hypophyse mehrmals mit einer sterilen, flammpolierten Pasteur-Pipette aus, bis Fragmente nicht mehr sichtbar sind.
Übertragen Sie die Suspension auf ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 4,5 Milliliter vorerwärmte DNAse-Lösung enthält. Spülen Sie den Kolben dreimal mit zwei Millilitern vorgewärmtem Medium C aus und geben Sie die Suspension in den Schlauch. Mischen Sie die gesammelte Zellsuspension und filtern Sie sie durch ein 40-Mikron-Zellsieb zu einem 30-Milliliter-Röhrchen.
Röhrchen und Zellsieb dreimal mit zwei Millilitern Medium C abspülen und die Suspension in den Schlauch überführen. Füllen Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas mit zwei Millilitern BSA. Positionieren Sie die Spitze der Pipette am Boden des Rohres und pipettieren Sie vorsichtig heraus, um eine sichtbare Dichteschicht zu bilden.
Bei 190 mal G zentrifugieren für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter eiskaltem Advanced DMEM/F-12. Quantifizieren Sie dann die Zellen mit einem Zellzähler.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 190 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Resuspendiert das Zellpellet in fortschrittlichem DMEM/F-12, um eine Zelldichte von 1,1 mal 10 bis zu den 6. Zellen pro Milliliter zu erreichen. Fügen Sie ECM zum gewünschten Volumen der Zellsuspension in einem Verhältnis von 30: 70 hinzu und mischen Sie gut.
Deponieren Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen dieser Mischung in jeder Vertiefung einer vorerwärmten 48-Well-Platte. Drehen Sie die Platte auf den Kopf und lassen Sie das ECM bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten erstarren. Nach der Inkubation fügen Sie vorsichtig 250 Mikroliter vorerwärmtes Hypophysen-Organoidmedium hinzu, das mit einem 10-Mikromolaren ROCK-Inhibitor ergänzt wird.
Wechseln Sie alle zwei bis drei Tage das Medium ohne ROCK-Inhibitor für 10 bis 14 Tage, bis die Organoide ausgewachsen sind. Um die Organoide zu passieren, saugen Sie zuerst das Medium vorsichtig ab und fügen Sie 400 Mikroliter eiskaltes fortschrittliches DMEM / F-12 hinzu, um das ECM aufzulösen. Sammeln Sie dann die Organoide in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
Waschen Sie den Brunnen mit 400 Mikrolitern eiskaltem DMEM/F-12. Zentrieren Sie das Röhrchen bei 200 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 400 Mikroliter vorgewärmtes TrypLE Express-Enzym hinzu.
Mischen Sie, indem Sie die Röhre mehrmals umkehren und bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Fügen Sie 400 Mikroliter eiskaltes fortschrittliches DMEM / F-12 hinzu. Bei 200 mal G fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Resuspendiert das Pellet mit 100 Mikrolitern eiskaltem DMEM/F-12. Verengen Sie eine P-200-Spitze und verwenden Sie die Spitze, um die Organoide durch kräftiges Pipettieren zu dissoziieren, bis Organoidfragmente erhalten sind. Fügen Sie 800 Mikroliter fortschrittliches DMEM / F-12 hinzu.
Bei 190 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen. Um die Organoide zu passieren, suspendieren Sie das Pellet in einem ausreichenden Volumen von fortgeschrittenem DMEM / F-12 und fügen Sie ECM in einem Verhältnis von 30: 70 hinzu. Gut mischen.
Samen und kultivieren Sie die Organoide weiter, wie im Textmanuskript beschrieben. Dissoziierte Einzelzellen aus dem vorderen Lappen wurden in ECM ausgesät und in Hypophysen-Organoid-Medium gezüchtet. 14 Tage nach der Aussaat waren die Organoide voll entwickelt und erreichten einen Durchmesser von bis zu 500 Mikrometern.
In diesem Stadium zeigten die Organoide eine zystische Morphologie mit einer Epithelschicht, die ein Lumen umschloss. Es wird nicht empfohlen, die Brunnen zu verwenden, in denen nach dem Wachstum dichte Strukturen auftreten. Für das Passieren wurden Organoidfragmente für die Aussaat verwendet.
Sieben Tage nach dem Passieren wurde ein günstiges organoides Nachwachsen mit zystischen Strukturen beobachtet. Dichte Organoide sollten verworfen werden, da die ungünstigen Organoide die Kultur übernehmen können. Die Immunfluoreszenz-Färbeanalyse für die epithelialen Marker E-Cadherin und Cytokeratine 8 und 18 bestätigte den epithelialen Charakter der Organoide.
Die Expression der Hypophysenstammzellmarker Sox2 und Trop2 zeigte die Stammheit, und der hypophysenspezifische Marker LHX3 zeigte den Hypophysenphänotyp der Organoide. Die Expression des Markers Ki67 zeigte, dass sich die organoidbildenden Zellen in einem proliferativen Zustand befinden. Die RTQ-PCR-Analyse zeigte eine höhere Expression von Stammheitsmarkern in den Organoiden als im Vorderlappen, selbst nach mehreren Passagen, was die Anreicherung von Stammzellen bestätigte.
Es ist wichtig, die entsprechende Anzahl von Einzelzellen in der ECM-Kuppel bei der anfänglichen Aussaat zu platten, und wenn man die Organoide passiert, muss man daran denken, Fragmente und nicht einzelne Zellen erneut zu säen.
