Wir wollen den Geist der Zusammenarbeit aller Caldwell Lab Mitglieder anzuerkennen. Ein Basil O&#39;Connor Scholar Award der March of Dimes und ein Career Award von der National Science Foundation an GAC, sowie ein Undergraduate Research Science Program Stipendium des Howard Hughes Medical Institute an der University of Alabama haben neuronale Erregbarkeit und finanziert Epilepsie-Forschung in den Caldwell Lab.

Aldicarb Exposure Paradigm <ol><li> Am ersten Tag, dass mindestens dreißig jungen erwachsenen Stadium Würmer von jedem Genotyp und der jede Wiederholung verfügbar sein wird für Aldicarb Assays am zweiten Tag. Am besten ist es, wenn ein Experimentator wählt fünfzig oder mehr L4 Stadium Würmer auf frische NGM-Platten (am besten ohne Nystatin), die E. enthalten coli (vorzugsweise OP50) als Nahrungsquelle, und wachsen sie für 12-24 Stunden bei einer konsistenten und permissiven Temperatur (20 ° C bis 22 ° C ist am besten, obwohl 25 ° C ist okay). </li><li> Am zweiten Tag, eine 100 mM Stammlösung von Aldicarb mit 70% Ethanol (EtOH) und 30% ddH 2 O. Verbreiten Sie den entsprechenden Betrag von Aldicarb auf NGM minus Nystatin Platten mit definierter Volumina, um die gewünschte Aldicarb Konzentrationen zu erreichen. Wir nutzen konsequent 0,5 mM Aldicarb durch Ausplattieren 37,5 ul 100 mM Aldicarb auf 7,5 ml NGM-Platten. Lassen Sie die Aldicarb Platten für etwa 30-60 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Es ist nicht notwendig, den Deckel zu knacken. Alternativ können Aldicarb auf NGM hinzugefügt werden und bei 4 ° C für eine Woche. &nbsp;</li><li> Nach dem Trocknen Platte konsistente Mengen von E. coli (vorzugsweise OP50) auf die Mitte jeder Platte Aldicarb und trocken für weitere 30-60 Minuten bei Raumtemperatur. Wir orientieren uns konsequent Platte 25 ul OP50, die eine ausreichend große Lebensmittel Rasen, um die Würmer in einem kleinen Ort konzentriert, ohne Überbelegung zu halten schafft. &nbsp;</li><li> Als das Essen Rasen trocken ist, kann man mit Aldicarb Assays gehen. Aufgrund der subjektiven Natur der Aldicarb-Assays ist es dringend empfohlen, dass Experimente durchgeführt &quot;blind&quot; werden. Ein Kollege von der primären Experimentator könnte re-label den ursprünglichen Platten mit Würmern zu untersucht werden. Ebenso könnte der Kollege Würmer aus der ursprünglichen Platten verschlüsselt Aldicarb Platten sofort in die vor dem Start eines Timers. Wenn der Experimentator erwartet Testen einer bestimmten Stamm der Würmer mit einem charakteristischen Phänotyp, wie uncoordination, dann muß es auch eine Steuerung mit einem ähnlichen Phänotyp, um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus ist es am besten, wenn der Experimentator Assays einer Wildtyp-Stammes, sowie ein resistenter Stamm und einer Überempfindlichkeit Belastung, parallel zur Standardisierung Experimente. Der Versuchsleiter sollte sich bemühen, eine einheitliche Anzahl von Würmern für jede Wiederholung zu analysieren. Wir orientieren uns konsequent analysieren thirty Würmer aus einem einzigen Genotyp für jede Wiederholung. Wir führen auch mindestens drei Replikate für jedes Experiment. Ein erfahrener Experimentator sollte in der Lage, mindestens sechs Stämme zu einem Zeitpunkt, zu analysieren. &nbsp;</li><li> Zählt die Anzahl der gelähmten Würmer durch Drängen auf konsistente Weise jeder Wurm mit einem Platindraht. Wir setzen konsequent unsere Produkte Würmer zweimal auf den Kopf und zweimal auf den Schwanz alle 30 Minuten für insgesamt drei Stunden. Einstellung der Rachen-Pumpen können auch zur Lähmung zu definieren, aber nur, wenn der Experimentator eine einheitliche Definition der Lähmung über alle Tests beschäftigt. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass einige Würmer, insbesondere diejenigen, die resistent gegen Aldicarb sind, kann versuchen, kriechen aus der Platte. In diesem Fall kann der Experimentator verbreiten eine gleichbleibende Menge an Palmitinsäure, eine physikalische Barriere gegen Wurm Fortbewegung, um die Aldicarb Platten. Wir verteilen 25 ul 10 mg Palmitinsäure / mL EtOH. </li></ol> PTZ Exposure Paradigm <ol><li> Am ersten Tag, dass mindestens dreißig jungen erwachsenen Stadium Würmer von jedem Genotyp und der jede Wiederholung verfügbar sein wird für PTZ-Assays am zweiten Tag. Am besten ist es, wenn ein Experimentator wählt fünfzig oder mehr L4 Stadium Würmer auf frische NGM-Platten (am besten ohne Nystatin), die E. enthalten coli (vorzugsweise OP50) als Nahrungsquelle, und wachsen sie für 12-24 Stunden bei einer konsistenten und permissiven Temperatur (20 ° C bis 22 ° C ist am besten, obwohl 25 ° C ist okay). </li><li> Am zweiten Tag, eine 0,5 g PTZ / mL ddH 2 O Stammlösung von PTZ. Verbreiten Sie die entsprechende Menge an PTZ auf NGM minus Nystatin Platten mit definierter Volumina, um die gewünschte PTZ-Konzentrationen zu erreichen. Weil wir Dosis-Wirkungs-Assays lieber für PTZ, wir Platte unterschiedliche Mengen von PTZ auf 7,5 ml NGM-Platten. Zum Beispiel kann man Teller 37,5 ul der PTZ-Stammlösung auf eine 7,5 ml NGM Platte zu machen eine 5 mg PTZ / ml-Lösung. Lassen Sie die PTZ-Platten für etwa 60-120 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Es ist nicht notwendig, den Deckel zu knacken. Alternativ können PTZ direkt an NGM hinzugefügt werden, aber es sollte sofort für Tests werden nach dem Erstarren verwendet. Die Stabilität des PTZ ist erheblich geringer als die von Aldicarb. Daher sind Tests mit älteren PTZ Platten weniger zuverlässig. PTZ sollte bei -20 ° C in einem Exsikkator mit Trockenmittel vor der Verwendung gelagert. Wir bevorzugen es, PTZ verwerfen etwa zwei Monate nach der Eröffnung, um die Stabilität zu gewährleisten. </li><li> Nach dem Trocknen Platte konsistente Mengen von E. coli (vorzugsweise OP50)auf die Mitte eines jeden PTZ Platte und trocken für weitere 30-60 Minuten bei Raumtemperatur. Wir orientieren uns konsequent Platte 25 ul OP50, die eine ausreichend große Lebensmittel Rasen, um die Würmer in einem kleinen Ort konzentriert, ohne Überbelegung zu halten schafft. &nbsp;</li><li> Als das Essen Rasen trocken ist, kann man mit PTZ-Assays vor. Obwohl PTZ-Assays weniger subjektiv als Aldicarb Assays sind, ist es dennoch dringend empfohlen, dass Experimente durchgeführt &quot;blind&quot; werden. Ein Kollege von der primären Experimentator könnte re-label den ursprünglichen Platten mit Würmern zu untersucht werden. Ebenso könnte der Kollege Würmer aus der ursprünglichen Platten verschlüsselt PTZ Platten sofort in die vor dem Start eines Timers. Wenn der Experimentator erwartet Testen einer bestimmten Stamm der Würmer mit einem charakteristischen Phänotyp, wie uncoordination, dann muß es auch eine Steuerung mit einem ähnlichen Phänotyp, um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus ist es am besten, wenn der Experimentator Assays einer Wildtyp-Stammes, sowie Stämme mit Front-oder Ganzkörper-Krämpfe, parallel zur Standardisierung Experimente. Der Versuchsleiter sollte sich bemühen, eine einheitliche Anzahl von Würmern für jede Wiederholung zu analysieren. Wir orientieren uns konsequent analysieren thirty Würmer aus einem einzigen Genotyp für jede Wiederholung. Wir führen auch mindestens drei Replikate für jedes Experiment. Ein erfahrener Experimentator sollte in der Lage, mindestens drei Stämme zu einem Zeitpunkt, zu analysieren. Dennoch dämpfen die Häufigkeit und Intensität von PTZ-induzierten Krämpfe in der Regel Höhepunkt zwischen 15-30 Minuten der Exposition, und dann als Würmer gelähmt zu werden oder, in einigen Fällen zu gewöhnen, um das Medikament. </li><li> Zählt die Anzahl der &quot;Epilepsie-ähnliche&quot; convulsing Würmer alle 30 Minuten für insgesamt eine Stunde. Am besten ist es, die Zahl der Würmer mit vorderen Krämpfe, die wir als &quot;head-Bobs&quot; score, getrennt von der Anzahl der Würmer mit Ganzkörper-Krämpfe, Ganzkörper-Lähmung, die wir als &quot;Tonic&quot;, oder eine Kombination aus vorderen Krämpfe mit BWM Lähmung, die wir als &quot;tonisch-klonischen&quot;. Die meisten Würmer aus einem einzigen Genotyp weisen nur eine Art von Erschütterung. Allerdings tonisch-klonischen Würmer häufig völlig Tonic, so sollte man den Test letzten 30 Minuten weiter, selbst wenn alle Würmer bereits Krämpfe gezeigt haben. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass einige Würmer kann versuchen, kriechen aus der Platte. In diesem Fall kann der Experimentator verbreiten eine gleichbleibende Menge an Palmitinsäure rund um den PTZ-Platten. Wir verteilen 25 ul 10 mg Palmitinsäure / mL EtOH. </li></ol> Verhaltensreaktionen ausgewählter C. elegans Synaptic Transmission Mutanten zu Aldicarb und PTZ <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Mutant Namen </th><th> Synaptic Rolle </th><th> Verhalten ohne Droge </th><th> Behavioral Response to Aldicarb (im Vergleich zu Wildtyp-N2) </th><th> Behavioral Response to PTZ </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> hemmt die synaptische Übertragung </td><td> unkoordiniert </td><td> höhere Geschwindigkeit der Lähmung </td><td> nicht von Wildtyp- </td></tr><tr><td> unc-43 (n498n1186) </td><td> Komplex </td><td> unkoordiniert </td><td> höhere Geschwindigkeit der Lähmung </td><td> Ganzkörper-Krämpfe </td></tr><tr><td> unc-25 (e156) </td><td> fördert GABA Übertragung </td><td> unkoordiniert </td><td> höhere Geschwindigkeit der Lähmung </td><td> vorderen Krämpfe, Ganzkörper-Lähmung </td></tr><tr><td> SNB-1 (md247) </td><td> fördert die synaptische Übertragung </td><td> unkoordiniert </td><td> ermäßigten Satz von Lähmung </td><td> vorderen Krämpfe </td></tr><tr><td> unc-4 (e120) </td><td> fördert ACh Übertragung </td><td> unkoordiniert </td><td> ermäßigten Satz von Lähmung </td><td> nicht von Wildtyp- </td></tr></tbody></table> Zwei neuronale Stimulanzien, ein Acetylcholinesterase-Hemmer genannt Aldicarb, und ein GABA-Rezeptor-Antagonist, genannt Pentylentetrazol (PTZ), kann in Ergänzung zu C. elegans synaptischen Übertragung Mutanten kennzeichnen verwendet werden. Überschüssiges exzitatorischen Acetylcholin (ACh) sammelt sich am Wurm Körperwand neuromuskulären Synapsen (NMJs) von schädlichen Mutationen in negative Regulatoren der ACh-Übertragung (zB tom-1 und unc-43) oder positive Regulatoren der hemmenden GABA-Übertragung (zB unc-25). Umgekehrt sind die erregenden ACh Ebenen, auf Wurm NMJs von schädlichen Mutationen in positive Regulatoren der allgemeinen synaptischen Übertragung (zB SNB-1) oder ACh-spezifische Übertragung Gene (zB unc-4) verringert. Wenn zum Wildtyp N2 Würmer zeigen gegenüber mutierten Würmer mit erhöhten exzitatorischen ACh-Übertragung bei NMJs verbesserten Raten von Aldicarb-induzierte Paralyse, während mutierten Würmer mit gesenktem erregenden ACh Übertragung ermäßigte Aldicarb-induzierte Paralyse zu demonstrieren. Obwohl PTZ stört neuronalen Synchronie bei C. elegans Körperwand Muskeln, nicht anders als Aldicarb, PTZ auch antagonisiert hemmenden GABA bei C. elegans Kopf Muskeln. Als Ergebnis kann Aldicarb Empfindlichkeit nicht genau vorhersagen, PTZ-Empfindlichkeit. Mutant Würmer mit bestimmten Defekten in negative oder positive regulATION von ACh Übertragung aus Wildtyp-N2 Würmer in Gegenwart von PTZ unterscheiden, während mutierten Würmer mit Defekten in positive Regelung der allgemeinen synaptischen Übertragung oder spezifische Defekte in inhibitorischen GABA Transmission aufweisen robust PTZ-induzierten vorderen Krämpfe. Darüber hinaus zeigen unc-43 loss-of-function-Mutanten Ganzkörper-Krämpfe in Gegenwart von PTZ und wahrscheinlich zusätzliche synaptische Übertragung Anomalien, die auf ihre einzigartigen Wirkstoff Lösungen beitragen.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

Aktuelle Protokolle für Aldicarb Exposition mit C. elegans nicht zulassen Experimentatoren zwischen Mutanten mit besonderen Defiziten der ACh Übertragung und Mutanten mit generalisierten Defizite in der synaptischen Übertragung zu unterscheiden, da beide Klassen von Mutanten Resistenz gegenüber Aldicarb. Ebenso können Aldicarb nicht verwendet werden, um festzustellen, ob Mutanten spezifische Defizite in GABA Übertragung oder generalisierte Ausfälle haben, negativ zu regulieren ACh Übertragung, da beide Klassen von Mutanten ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans, hat sich eine sinnvolle Modell für die Untersuchung Neurotransmission. C. elegans ist einzigartig unter den Tiermodellen, wie die Anatomie und Anschlussfähigkeit seiner Nervensystem aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen ermittelt und verfeinert durch pharmakologische Tests. In diesem Video, beschreiben wir, wie zwei sich ergänzende neuronalen Stimulanzien, ein Acetylcholinesterase-Hemmer genannt Aldicarb, und ein Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptor-Antagonist, genannt Pentylentetrazol (PTZ), eingesetzt werden können, um speziell kennzeichnen Signalisierung bei C. elegans neuromuskulären Endplatten (NMJs) und erleichtern das Verständnis der antagonistischen neuronalen Schaltkreisen. Von 302 C. elegans Neuronen, neunzehn GABAergen D-Typ-Motoneuronen innervieren Körperwand Muskeln (BWMs), während vier GABAergen Neuronen, genannt RMEs, innervieren Kopf Muskeln. Umgekehrt äußern 39 Motoneuronen des erregenden Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) und antagonisieren GABA-Übertragung bei BWMs die Fortbewegung zu koordinieren. Die antagonistische Natur der GABAergen und cholinergen Motoneuronen bei Körpertemperatur Wand NMJs wurde zunächst durch Laserablation ermittelt und später von Aldicarb Exposition untermauert. Akute Aldicarb Exposition führt zu einer zeitlichen Verlauf oder Dosis-responsive Lähmung in Wildtyp-Würmer. Dennoch verleiht Verlust von erregenden ACh Übergangswiderstände zu Aldicarb, als weniger ACh sammelt sich am Wurm NMJs, was zu weniger Stimulation BWMs. Der Widerstand gegen Aldicarb kann mit ACh-spezifische oder allgemeine synaptische Funktion Mutanten beobachtet werden. In Übereinstimmung mit antagonistischen GABA und ACh Übertragung, Verlust von GABA Übertragung oder einen Verstoß gegen negativ regulieren ACh Freisetzung verleiht Überempfindlichkeit gegen Aldicarb. Obwohl Aldicarb Exposition auf die Isolierung von zahlreichen Wurm Homologen der Neurotransmission Gene geführt hat, Aldicarb Exposition allein nicht effizient bestimmen vorherrschenden Rollen für Gene und Signalwege in bestimmten C. elegans Motoneuronen. Zu diesem Zweck haben wir eine komplementäre experimentelle Ansatz, der PTZ verwendet eingeführt. Neurotransmission Mutanten Anzeige zu löschen Phänotypen, die sich von Aldicarb-induzierte Paralyse, in Reaktion auf PTZ. Wild-Typ Würmer, sowie Mutanten mit spezifischen Unfähigkeit zur Veröffentlichung oder zu empfangen ACh, zeigen nicht erkennbar Sensibilität für PTZ. Jedoch zeigen die GABA-Mutanten, sowie allgemeine synaptische Funktion Mutanten, anterior Krämpfe in einer Zeit-Gänge-oder Dosis-responsive Art und Weise. Mutanten, die nicht negativ regulieren allgemeine Freisetzung von Neurotransmittern können und somit ausscheiden übermäßige Mengen von ACh auf BWMs, gelähmt auf PTZ. Die PTZ-induzierten Phänotypen von diskreten mutierten Klassen zeigen, dass ein komplementärer Ansatz mit Aldicarb und PTZ Exposition Paradigmen in C. elegans kann unser Verständnis der Neurotransmission zu beschleunigen. Darüber hinaus sollten die Videos zeigen, wie wir pharmakologische Tests durchführen zu etablieren konsistente Methoden für C. elegans Forschung.

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Dieses Video zeigt, wie zwei neuronalen Stimulanzien, Aldicarb und Pentylentetrazol (PTZ), in komplementärer Weise zu synaptische Funktion in dem Fadenwurm C. elegans Studie beschäftigen. Mit diesem ergänzenden Ansatz kann auch verwendet werden, um Licht auf evolutionär konservierte Mechanismen zur Modulation neuronaler Synchronität vergossen werden und hat Auswirkungen auf Epilepsie und Krampfanfällen.

Paradigmen für pharmakologische Charakterisierung von C. elegans Synaptic Transmission Mutanten

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  University of Alabama. Dieses Video zeigt, wie zwei neuronalen Stimulanzien, Aldicarb und Pentylentetrazol (PTZ), in komplementärer Weise zu synaptische Funktion in dem Fadenwurm C. elegans Studie beschäftigen. Mit diesem ergänzenden Ansatz kann auch verwendet werden, um Licht auf evolutionär konservierte Mechanismen zur Modulation neuronaler Synchronität vergossen werden und hat Auswirkungen auf Epilepsie und Krampfanfällen.

Serie: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemotaxis-Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...