Diese Protokolle ermöglichen es den Forschern, über die bloße Messung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs hinauszugehen und stattdessen die Messung wichtiger mitochondrialer Endprodukte, ATP und reaktiver Sauerstoffspezies, zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Forscher die mitochondriale Effizienz messen kann, indem er die Rate des Sauerstoffverbrauchs direkt mit der Rate der Endproduktproduktion vergleicht. Unabhängig davon, ob es sich bei dem Endprodukt um ATP oder reaktiven Sauerstoff handelt.
Die Techniken erfordern eine sehr sorgfältige Liebe zum Detail, insbesondere bei der Vermeidung von Blasen. Egal, ob sie sich in der Beatmungskammer oder in Titrationsspritzen befinden, Blasen sind Ihr Feind, da sie die Messungen weniger genau machen. Nach der Entnahme der Skelettmuskelbiopsien.
Füllen Sie die Respirometerkammern mit magnesiumfreien Medien und verschließen Sie die Inkubationskammer. Stellen Sie die Inkubationstemperatur des Instruments auf 38 Grad Celsius ein, um die Basaltemperatur der Skelettmuskulatur des Pferdes darzustellen. Stellen Sie das Mischen des Beatmungsmediums auf 750 U/min ein, indem Sie einen magnetischen Rührer am Boden der Respirometerkammer drehen.
Schalten Sie als Nächstes die Kammerbeleuchtung aus, um Interferenzen mit Leuchtstoffsensoren zu vermeiden. Versorgen Sie die Sauerstoffelektrode mit einer Polarisationsspannung von 800 Millivolt und verstärken Sie das resultierende Signal mit einer Verstärkungseinstellung von eins. Zeichnen Sie die Sauerstoffkonzentration alle zwei Sekunden auf und berechnen Sie den Sauerstofffluss als negative Steigung der Sauerstoffmessung über die folgenden 40 Sekunden.
Kalibrieren Sie dann den Sauerstoffsensor, indem Sie das Medium mit der Raumluft ausgleichen lassen. Berechnen Sie den Referenzsauerstoffpartialdruck basierend auf dem mit dem hochauflösenden Respirometer gemessenen Luftdruck und der Standard-Luftsauerstoffkonzentration. Verwenden Sie grüne Fluoreszenzsensoren, um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren.
Schaltet man die Sensoren mit 400 bis 500 Millivolt ein, wird das resultierende Signal mit einer Verstärkung von 1 bis 1.000 verstärkt. Als nächstes fügen Sie TMRM in die Beatmungskammer hinzu, bevor Sie Mitochondrien hinzufügen, und kalibrieren Sie das Fluoreszenzsignal mit einer einfachen Zwei-Punkt-Kalibrierung des Fluoreszenzsignals im Vergleich zur Menge des hinzugefügten Fluorophors vor der Zugabe der Mitochondrien. Führen Sie die endgültige Kalibrierung des TMRM-Signals nach Abschluss des Respirometrie-Titrationsprotokolls durch, indem Sie mehrere Titrationen des Entkopplungsmittels durchführen, bis keine weiteren Anstiege des TMRM-Fluoreszenzsignals beobachtet werden, was auf einen vollständigen Kollaps des mitochondrialen Membranpotentials hinweist.
Verwenden Sie blaue Fluoreszenzsensoren, um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren, und aktivieren Sie diese Sensoren für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen. Geben Sie acht Mikroliter zweimillimolares EDTA in die Atemkammer, um Kationen zu chelatisieren, die mit Magnesiumionen um die Bindung an Magnesiumgrün konkurrieren würden. Geben Sie dann vier Mikroliter eines millimolaren Magnesiumgrüns in die Beatmungskammer.
Kalibrieren Sie das rohe Fluoreszenzsignal mit 10 x 2 Mikrolitern sequenziellen Titrationen von 100 millimolarem Magnesiumchlorid, wobei zwischen den Titrationen eine Minute zur Stabilisierung des Fluoreszenzsignals eingeplant wird. Bestimmen Sie die ATTP-Syntheserate, d. h. die Steigung der ATP-Konzentration im Laufe der Zeit im gesamten Protokoll. Verwenden Sie grüne Fluoreszenzsensoren, um das Fluoreszenzsignal aus der Beatmungskammer zu quantifizieren.
Versorgen Sie die Sensoren mit 300 bis 400 Millivolt. Und das resultierende Signal wird mit einer Verstärkung von 1 bis 1.000 verstärkt. Optimieren Sie spezifische Einstellungen für einzelne Instrumente, um das erwartete Signal innerhalb des linearen Bereichs des Sensors zu erfassen.
Bevor Sie die Mitochondrien hinzufügen, führen Sie den chemischen Aufbau und die Erstkalibrierung des Amplex UltraRed Assays durch. Fügen Sie 30 Mikromol DTPA hinzu, um Kationen zu chelatisieren, die die Reaktion stören könnten. Geben Sie dann Superoxiddismutase oder Serratusperoxidase und Amplex UltraRed in die Respirometriekammer.
Lassen Sie das Fluoreszenzsignal stabilisieren. Fügen Sie dann zweimal 0,2 Mikromol Wasserstoffperoxid im Abstand von fünf Minuten hinzu. Führen Sie zusätzliche Zwei-Punkt-Kalibrierungen während des gesamten Assays durch, um die Reaktionsfähigkeit des Assays anpassen zu können, da sich die Chemie der Respirometrie während des Assays mit dem spezifischen Timing dieser Kalibrierungspunkte nach Ermessen des Prüfers ändert.
Wirbeln Sie die Probe vor, um eine gleichmäßige Probensuspension aufrechtzuerhalten, und fügen Sie 15 Mikroliter isolierte Mitochondriensuspension in jede Zwei-Milliliter-Inkubationskammer hinzu, so dass die Ergebnisse die mitochondriale Ausbeute von 18,75 Milligramm Muskel darstellen. Messen Sie vor der Zugabe von Substraten den Restsauerstoffverbrauch und subtrahieren Sie diesen Wert nach Abschluss von den Sauerstoffverbrauchswerten jedes Schritts in der Titration des substratentkoppelten Inhibitors oder des SUIT-Protokolls. Verwenden Sie einen Allzweck-SUIT, der die anfängliche Charakterisierung der mitochondrialen Funktion der Skelettmuskulatur von Pferden ermöglicht.
Beginnen Sie mit sequenziellen Titrationen von Pyruvat, Glutamat und Malat ineinander in jede Kammer, um Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid zu produzieren und die nichtphosphorylierende Atmung zu stimulieren, die durch NADH unterstützt wird, das durch komplexes einsbasiertes Leck oxidiert wird. Fügen Sie dann ADP hinzu, um die phosphorylierende Atmung durch eine phosphorylierende Atmung zu stimulieren. Fügen Sie Succinat hinzu, um eine phosphorylierende Atmung zu erzeugen, indem Sie Komplex eins und Komplex zwei phosphorylierende Atmung kombinieren Fügen Sie Rotenon hinzu, um Komplex eins zu blockieren.
Der resultierende Sauerstofffluss stellt die Fähigkeit des zweiten Komplexes dar, den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch allein durch die Oxidation von Succinat zu unterstützen. Eine hochauflösende Respirometriespur der mitochondrialen Atmung der Skelettmuskulatur des Pferdes und des relativen Membranpotentials wird gezeigt. Die Atmungswerte von Mitochondrien, die mit TMRM inkubiert wurden, sind aufgrund einer hemmenden Wirkung dieses Fluorophors niedriger.
Die mitochondriale Atmung und die ATTP-Synthese von Skelettmuskeln von Pferden, die einen hohen Anteil an mitochondrienreichen Typ-1-Skelettmuskelfasern enthalten und unter Bedingungen inkubiert werden, die dem Ruhestoffwechsel nahe kommen, werden gezeigt. Die Respirometrie, die Spur der mitochondrialen Atmung der Skelettmuskulatur des Pferdes und die Produktion von Wasserstoffperoxid wird gezeigt. Hochauflösende Respirometrie erfordert viel Geduld.
Die Person, die den Assay durchführt, hat zahlreiche Zeitpunkte, an denen sie eine Entscheidung darüber treffen muss, ob ein stationärer Zustand erreicht wurde und der nächste Schritt erfolgen kann. Wir haben nur ein einziges Titrationsprotokoll demonstriert. Es gibt Dutzende weiterer Protokolle, die auf die gleiche Weise angewendet werden können, um spezifische Fragen zum mitochondrialen Stoffwechsel zu beantworten.
