Dieses Protokoll zielt darauf ab, Gehirnorganoide zu verwenden, um mitochondriale Erkrankungen zu untersuchen. Es wurde entwickelt, um reproduzierbare Gehirnorganoide bei der Beurteilung ihrer mitochondrialen Eigenschaften zu erzeugen. Diese Methode erfordert keine teuren Bioreaktoren und zeitaufwändigen Einbettungsverfahren.
Daher ist es einfach zu implementieren und zu skalieren. Dieses Protokoll ermöglicht es, reproduzierbare Hirnorganoide zu erzeugen und ihre mitochondrialen Eigenschaften zu testen. Dies kann zur Identifizierung von interventionellen Zielen für nicht behandelbare Mitochondria-Erkrankungen führen.
Zunächst werden menschliche iPS-Zellen unter feederfreien Bedingungen in iPSC-Medium auf beschichteten Sechs-Well-Platten kultiviert und in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid aufbewahrt. Passage der iPS-Zellen bei 80% Konfluenz unter Verwendung von enzymfreiem Ablösungsmedium in Verhältnissen von eins zu vier bis eins zu 12. Um das Überleben der Zellen zu erhöhen, fügen Sie nach jeder Spaltung 10 mikromolare Rho-assoziierte Proteinkinase oder ROCK-Inhibitor hinzu.
Dissoziieren Sie die 80% iPSCs am Tag Null. Bereiten Sie das kortikale Differenzierungsmedium eins oder CDM1 vor und erwärmen Sie es bei Raumtemperatur vor, bevor Sie es den Zellen hinzufügen. Waschen Sie die Vertiefungen, die die iPS-Zellen enthalten, mit PBS, um abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
500 Mikroliter vorgewärmtes Reagenz A in jede Vertiefung geben und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, um die Zellablösung sicherzustellen. Fügen Sie einen Milliliter iPSC-Medium hinzu, um Reagenz A zu verdünnen, um seine Aktivität zu neutralisieren.
Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Zellen durch Auf- und Abpipen zu dissoziieren und die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie die iPS-Zellen vorsichtig bei 125 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand, um das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet mit einem Milliliter CDM1, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten und die Zellzahl zu zählen.
Bereiten Sie das Aussaatmedium mit 9.000 iPS-Zellen pro 100 Mikroliter in CDM1 vor, ergänzt mit 20 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, drei mikromolaren WNT-Catenin-Inhibitoren oder IWR-1 und fünf mikromolaren SB-431542. 100 Mikroliter Saatmedium pro Vertiefung auf eine 96-Well-V-Bodenplatte geben. Bewahren Sie die Platte in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid auf.
Um Neurosphären zu erzeugen, beobachten Sie am ersten Tag, dass sich runde Zellaggregate mit definierten glatten Grenzen bilden. Beachten Sie die toten Zellen um die Aggregate. Kultivieren Sie weiter im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Am dritten Tag rühren Sie die Platte, indem Sie dreimal auf die Seiten klopfen, um abgestorbene Zellen zu lösen, und fügen Sie dann 100 Mikroliter CDM1 hinzu, ergänzt mit 20 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, drei mikromolaren IWR-1 und fünf mikromolaren SB-431542 zu jeder Vertiefung. Halten Sie die Platte am Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Entfernen Sie am sechsten Tag vorsichtig 80 Mikroliter des überstehenden Mediums aus jeder Vertiefung.
Vermeiden Sie es, den Boden des Brunnens zu berühren. Fügen Sie 100 Mikroliter CDM1, ergänzt mit drei mikromolaren IWR-1 und fünf mikromolaren SB-431542, zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt alle drei Tage bis zum 18. Tag.
Bereiten Sie am Tag 18, um Neurosphären zu übertragen, CDM2 vor und fügen Sie 10 Milliliter zu einer 100 Millimeter ultra niedrigen Anhaftungszellkulturplatte hinzu. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um die runden Neurosphären von der 96-Well-Platte auf die 100-Millimeter-Zellkulturplatte mit extrem niedriger Befestigung zu übertragen. Entfernen Sie fünf Milliliter Medium von der Platte, die die Neurosphären enthält, und fügen Sie fünf Milliliter frisches CDM2 hinzu.
Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler mit 70 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Alle drei Tage das überstehende Medium vorsichtig absaugen und durch frisches CDM2 ersetzen. Lassen Sie eine kleine Menge des Mediums, um zu verhindern, dass Neurosphären austrocknen.
Bereiten Sie am Tag 35 CDM3 vor. Saugen Sie das Medium von der Platte ab und fügen Sie 10 Milliliter kaltes CDM3 hinzu. Nachdem Sie das Medium gewechselt haben, legen Sie die Platte mit 70 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid wieder auf einen Orbitalschüttler.
Wechseln Sie das Medium alle drei bis fünf Tage, abhängig von der Wachstumsrate, die durch die Farbe des Mediums angezeigt wird. Bereiten Sie am Tag 70 CDM4 vor. Verwenden Sie CDM4 Medium, bis das gewünschte Alter der Organoide erreicht ist.
Während dieser Zeit halten Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler, der bei 70 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid eingestellt ist. Wechseln Sie das Medium je nach Wachstumsrate alle drei bis fünf Tage. Bereiten Sie 4% PFA-Lösung vor und legen Sie sie unter eine Sicherheitshaube.
Sammeln Sie Gehirnorganoide und übertragen Sie sie vorsichtig mit einer stumpfen Pasteur-Pipette aus drei Millilitern Kunststoff auf eine mit PFA gefüllte Sechs-Well-Platte. Bewahren Sie die Organoide in der PFA-Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur auf. Entfernen Sie die PFA vorsichtig mit einer drei Milliliter kunststoffhaltigen Pasteurpipette und waschen Sie die festen Organoide dreimal mit PBS.
Lagern Sie die festen Organoide bei vier Grad Celsius in PBS bis zur weiteren Verwendung. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide enthalten reife Neuronen, die mit Proteinmarkern, die für Axone und Dendriten spezifisch sind, visualisiert werden können. Reife Organoide enthalten nicht nur neuronale Zellen, sondern auch Gliazellen.
Mit Hilfe der Sliced-Brain-Organoid-Analyse ist es möglich, SMI 312-positive Axone und MAP2-positive Dendriten oder die S100-Beta-Gliazellen zu überwachen. Darüber hinaus helfen konfokale Bilder, die detaillierte Verteilung und Organisation von SOX2-positiven neuronalen Vorläufern in Bezug auf Beta-3-Tubulin-positive Neuronen zu untersuchen. Gehirnorganoide wurden für mitochondrienspezifische Marker wie Translokase der äußeren Membran oder TOM20 gefärbt.
Die bioenergetische Profilierung von Hirnorganoiden wurde durchgeführt, indem sowohl der mitochondriale Metabolismus unter Verwendung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als auch der glykolytische Metabolismus unter Verwendung der extrazellulären Säuerungsrate (ECAR) gemessen wurden. Oligomycin verursacht einen Abfall des OCR-Profils und identifiziert daher die OCR, die für die ATP-Produktion benötigt wird. Bei der Oligomycin-Behandlung kann es auch zu einem kompensatorischen Anstieg des ECAR kommen, was darauf hindeutet, dass die Zellen die Glykolyse hochregulieren können, um den metabolischen Stress zu verhindern.
Bei der Übertragung der Neurosphären von der 96-Well-Platte auf eine Kulturplatte oder während des Fixiervorgangs ist es wichtig, die Organoide sanft zu behandeln, um sie nicht zu beschädigen. Nach der Erzeugung von Hirnorganoiden wären Multi-Elektroden-Array oder Calcium-Imaging ideale Methoden, um die Funktionalität der Organoide zu testen.
