Dieses Protokoll erweitert den sehr gebräuchlichen Kratzwundtest, der für Regenerationsstudien verwendet wird, um enteroid-abgeleitete Monoschichten, die alle wichtigen Zelltypen des Dünndarms repräsentieren. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung des Wundverschlusses in einem vorzeitigen enteroiden 2D-Monolayer-Modell der Darmregeneration. Unsere Technik kann auf die Untersuchung des Frühgeborenendarms von Säugetieren angewendet werden, der typischerweise schlecht mit transformierten Darmkrebszelllinien modelliert wird.
Beginnen Sie mit dem Auftauen von 96 Mikrolitern extrazellulärer Matrix oder ECM-basiertem Hydrogel BME über Nacht auf Eis bei zwei bis acht Grad Celsius. Verdünnen Sie das ECM-basierte Hydrogel und eiskaltes PBS ohne Kalzium oder Magnesium im Verhältnis eins zu 50. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 200 Mikrolitern eiskalt verdünntem Hydrogel auf ECM-Basis und inkubieren Sie die beschichtete Platte für mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Dann saugen Sie das Medium von der 24-Well-Kulturplatte ab, die die für Monoschichten bestimmten 3D-Enteroide enthält, und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter Zelldissoziationsreagenz pro Well. Brechen Sie die ECM-basierten Hydrogelkuppeln manuell, indem Sie acht- bis 12-mal auf und ab pipettieren und den Inhalt von 12 Vertiefungen in ein 15-Milliliter-konisches Rohr übertragen. Waschen Sie die 12 leeren Vertiefungen mit 250 Mikrolitern Zelldissoziationsreagenz, um sicherzustellen, dass alle Enteroide entfernt wurden, und geben Sie den Inhalt in konische 15-Milliliter-Röhrchen.
Die konischen Röhrchen bei 300g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. 10 Milliliter eiskalter DMEM/F-12-Waschpuffer in die konischen Röhrchen geben und die enteroiden Pellets durch Inverdrehen der Röhrchen aufhängen. Bei 300g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Resuspendieren Sie die Zellpellets in 12 Milliliter 37 Grad Celsius Trypsin-EDTA und legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad oder bis die Zellen löslich erscheinen. Fügen Sie drei Milliliter DMEM / F-12-Waschpuffer in jedes Röhrchen hinzu, um Trypsin-EDTA zu verdünnen. Durch Umdrehen der Röhrchen mischen und auf Eis legen.
Filtern Sie die dissoziierten Enteroide durch ein 37 Mikrometer großes Maschenzellsieb. Sammeln Sie den Inhalt in sauberen 15-Milliliter-konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand aus den konischen Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellpellets mit sechs Milliliter HOMGY.
Als nächstes entfernen Sie die ECM-basierte Hydrogel-beschichtete Platte aus dem Inkubator und saugen Sie überschüssige ECM-basierte Hydrogellösung ab, ohne die beschichtete Oberfläche zu zerkratzen oder die Platte vollständig auszutrocknen. Fügen Sie 500 Mikroliter der kombinierten 12 Milliliter HOMGY-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte hinzu, die mit ECM-basiertem Hydrogel beschichtet ist. Schwenken Sie die Platte mit aufgesetztem Deckel, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid und wechseln Sie alle zwei Tage HOMGY-Medien, bis die Monoschichten mehr als 90% Konfluenz erreichen. Sobald die Monoschichten eine Konfluenz von mehr als 90% erreicht haben, saugen Sie das Medium ab, um alle Zellen zu entfernen, die sich nicht anhaften. Behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern HA35 oder PBS, gelöst in HOMGY für 24 Stunden.
Danach entfernen Sie das Medium, ohne die Oberfläche der Monoschicht zu stören. Machen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze einen linearen Kratzer über den gesamten Oberflächendurchmesser der Monoschicht in jeder Vertiefung und achten Sie darauf, die Monoschichten nicht trocknen zu lassen. Waschen Sie die zerkratzten Monolagen einmal mit 500 Mikrolitern 1X PBS und fügen Sie 500 Mikroliter HA35 oder PBS gelöst in HOMGY hinzu.
Die Platte wird innerhalb eines Inkubators mit 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in das Analysegerät für lebende Zellen überführt. Klicken Sie in der Live-Zellanalyse-Software unter dem Symbol Zeitplan auf das Symbol Assistent zum Hinzufügen neuer Schiffe starten. Wählen Sie Scan on Schedule (Nach Zeitplan scannen) und klicken Sie dann auf Next (Weiter).
Wählen Sie Neu unter Schiff erstellen und klicken Sie auf Weiter, wählen Sie dann Whole Well unter Scan Type (Scantyp) und klicken Sie auf Next (Weiter). Wählen Sie Phase für Bildkanäle und 4x für das Objektiv. Wählen Sie den Plattenhersteller und die Katalognummer aus der bereitgestellten Liste aus und klicken Sie auf Weiter.
Wählen Sie eine leere Gefäßposition gefolgt von dem gewünschten Scanmuster aus. Geben Sie den Kennzeichennamen in Name ein, und wählen Sie dann plus aus, um ein Plattenlayout zu erstellen. Wählen Sie ein kleines Plus, um einen Behandlungsnamen zu erstellen.
Geben Sie den Kurznamen und dann OK ein. Markieren Sie die Plattenschächten, die dieser Behandlung entsprechen, und treffen Sie ein großes Plus, um Vertiefungen mit dieser Behandlung zu kennzeichnen. Geben Sie die Konzentration der Verbindung ein und klicken Sie auf OK. Wenn die Platte fertig ist, wählen Sie OK, Weiter. Wählen Sie Analyse auf später verschieben und anschließend Neuen Zeitplan mit Scans in Intervallen von vier Stunden erstellen.
Stoppen Sie das Scannen an einem Tag, null Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Zusammenfassung korrekt ist, und fügen Sie sie dann dem Zeitplan hinzu. Wählen Sie in der Live-Zellanalyse-Software oben auf dem Bildschirm Ansicht aus.
Navigieren Sie im Menü Schiffsname zu Ihrem abgeschlossenen 24-Stunden-Scan und doppelklicken Sie auf den Schiffsnamen. Wählen Sie das Symbol Bilder und Filme exportieren auf der linken Seite, gefolgt von der Option Wie angezeigt. Markieren Sie die Vertiefungen von Interesse, und wählen Sie dann die gewünschten Zeitpunkte und die angezeigte Bildserie aus.
Stellen Sie sicher, dass der Sequenztyp und die Scans korrekt sind. Wählen Sie den gewünschten Speicherort des Zielordners aus. Wählen Sie JPEG aus dem Dropdown-Menü und dann Exportieren.
Öffnen Sie die ImageJ-Software und laden Sie das Kratzwund-Assay-Bild hoch. Wählen Sie Bild aus, und geben Sie dann 8-Bit ein, um das Bild von 24-Bit-RGB zu ändern. Wählen Sie Plugins, Makros, Installieren Wound_healing_size Plugin aus, um das Wundheilungsgrößen-Plugin zu installieren.
Danach setzen Sie den Radius des Varianzfensters auf 20, den Schwellenwert auf 100, den Prozentsatz der gesättigten Pixel auf 0,001. Ja für Set Scale global und klicken Sie dann auf OK. Stellen Sie sicher, dass der umrissene Bereich der Wundbereich ist, und wiederholen Sie den Vorgang für zusätzliche Kratzer. Berechnen Sie schließlich den Prozentsatz der Wundheilung im Kratzbereich von wandernden oder proliferierenden Zellen über 24 Stunden unter Verwendung der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung.
Hier ist T0 der Bereich zum Zeitpunkt Null Stunden und TC ist der Bereich bei null Stunden, vier Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden. Die enteroide Generierung und das enteroid-abgeleitete Monolayer-Wundheilungsverfahren sind in diesen Bildern dargestellt. Eine Kultur von dreidimensionalen, nicht-menschlichen Primaten-Darm-Enteroiden wird verwendet, um in zweidimensionale Monoschichten zu dissoziieren.
Monoschichten wurden auf mehr als 90% Konfluenz in einer 24-Well-Platte gezüchtet und dann 24 Stunden lang mit HA35 oder PBS behandelt. Monolagen wurden dann mit einer P200-Pipettenspitze zerkratzt. Hier sind die repräsentativen Bilder von HA35 in Kontrollbehandlungen von enteroiden Monoschichten nichtmenschlicher Primaten gezeigt.
Die Bilder wurden nach null Stunden, vier Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden nach dem Scratchen mit einer P200-Pipettenspitze aufgenommen. Die Wirkung von HA35 auf Wundheilung und oide Monoschichten wird hier gezeigt. Die Veränderung der Wundheilung im Laufe der Zeit in enteroiden Monoschichten ist abhängig von der HA35-Behandlungskonzentration.
HA35 erhöhte signifikant die Wundheilung nach vier Stunden und 12 Stunden bei 100 Mikrogramm pro Milliliter und 200 Mikrogramm pro Milliliter im Vergleich zur Kontrolle, aber die Heilungsraten konvergierten zwischen den Behandlungen um 24 Stunden. Eines der wichtigsten Dinge, an die man sich bei diesem Verfahren erinnern sollte, ist, dass intestinale enteroide Monoschichten kurzlebig sind. Sobald sie zu 90% konflüssig sind, sollten die Ermittler versuchen, sie schnell zu verwenden.
Diese Technik ist zu unserem bevorzugten Modell für die vorzeitige Darmregeneration in vitro geworden, insbesondere wenn wir eher an mechanischen als an entzündlichen Verletzungen interessiert sind.
