Das Protokoll kombiniert ein Mausmodell des Bauchaortenaneurysmas, das einer etablierten menschlichen Erkrankung ähnelt, und eine wiederholte Behandlung mittels intravenösem Katheter. Um die klinische Notwendigkeit zu adressieren, die Progression des Aneurysmas zu blockieren. Das Protokoll bietet einen vollständigen Workflow zum Testen von Medikamenten zur Verringerung der Aneurysmaprogression bei Mäusen, einschließlich umfassender Informationen über die Erweiterung des Aortendurchmesservolumens und der Morphologie.
Plus 3D-Ultraschall. 3D-Ultraschall kann angepasst werden, um die infrarenale Aorta zu messen, wo sich Aneurysmen in weniger geschmacksbasierten Mausmodellen entwickeln. Die Jugularvenenkatheterisierung kann für jede Reihe von intravenösen Injektionen verwendet werden.
Nach der Betäubung der 12 bis 14 Wochen alten APOE-defizienten Mail-Maus rasieren Sie den kleinen Bereich auf der oberen linken Seite des Rückens, über das Schulterblatt, tragen Sie 10% Povidon-Jodlösung auf, um den rasierten Bereich zu desinfizieren. Machen Sie einen einen Zentimeter langen transversalen Schnitt in der Haut des oberen Rückens mit einem Skalpell zwischen der mittleren Spinal- und der linken Skapulierlinie. Halten Sie die Haut mit einer Pinzette und einer stumpfen gebogenen Schere hoch.
Machen Sie eine Unterhauttasche, indem Sie in Richtung der linken Hinterbein drücken. Öffnen Sie die Schere und ziehen Sie die offene Schere aus dem Schnitt, um die Tasche zu erweitern. Führen Sie die Pumpe vorsichtig in die Tasche mit dem Strömungsmoderator in Richtung Schwanz ein, um mögliche Störungen von Angiotensin zwei zu minimieren, die von der Inzisionsstelle freigesetzt werden.
Dann schließen Sie die Wunde mit 4,0 resorbierbaren unterbrochenen Nähten. Verwendung des vaskulären Zugangssystems. Bereiten Sie den Katheter vor, indem Sie die drei französischen Seiten auf die gewünschte Länge schneiden und den Katheter über den 22-Gauge-Metallverbinder des Gefäßzugangssystems oder VAS mit mindestens drei Millimetern Überlappung schieben.
Setzen Sie die Aluminiumkappe auf den Knopf, um den Anschluss zu schützen. Rasieren Sie das Fell von der rechten Seite des Halses auf der ventralen Seite und der rechten Seite des oberen Rückens einer betäubten Maus. Tragen Sie dann die Povidon-Jodlösung auf, um den rasierten Bereich zu desinfizieren.
Für die Vorbereitung der Halsvene machen Sie einen 0,5 Zentimeter großen transversalen Superklavikular-Hautschnitt an der rechten Seite des Halses über dem rechten Schlüsselbein. Verwenden Sie eine stumpfe mikrochirurgische Pinzette, um Bindegewebe und Fett zu trennen, wodurch die äußere Halsvene freigelegt wird. Vermeiden Sie es, kleine Blutgefäße im Fett zu reißen.
Isolieren Sie fünf Millimeter des Gefäßes in der Nähe der Brustmuskeln. Dann stumpf das Gewebe unter der Vene mit einer gebogenen Mikropinzette und passieren Sie zwei bis drei der 6,0 Seidenligaturen. Stecken Sie die Ligaturen ein und fügen Sie der Website einen Tropfen Kochsalzlösung hinzu.
Für die Knopfimplantation drehen Sie die Maus um und legen Sie sie in die Bauchlage. Tragen Sie die Povidon-Jodlösung auf, um den rasierten Bereich zu desinfizieren. Machen Sie einen einen Zentimeter langen sagittalen Schnitt am oberen Rücken mit einem Skalpell zwischen der mittleren spinalen und rechten Skapulierlinie.
Als nächstes verwenden Sie eine stumpf gebogene Schere, um eine kreisförmige Tasche zu machen, die etwas größer ist als die Größe des VAS um die Inzisionsstelle durch stumpfe Dissektion. Verwenden Sie die stumpf gebogene Schere, um kranial über die rechte Schulter in Richtung des ventralen Einschnitts am Hals zu tunneln, indem Sie die Schere leicht öffnen. Dann ziehen Sie die geöffnete Schere heraus und wiederholen Sie die Aktion, während sie weiter hineingeschoben wird.
Sobald der Tunnel den ventralen Schnitt erreicht hat, gehen Sie durch chirurgische Klemmen von der ventralen zur dorsalen Inzision. Befestigen Sie drei französische Enden des Katheters an der Klemme und ziehen Sie den Katheter durch den Tunnel, so dass er aus dem ventralen Halsschnitt heraus ist und das VAS am dorsalen Einschnitt vorhanden ist. Führen Sie dann die VAS-OP-Filzscheibe subkutan am Rückenschnitt ein.
Lösen Sie den Katheter auf Durchgängigkeit mit dem Gabelende des Handhabungswerkzeugs, um die schützende Aluminiumkappe zu entfernen, und verwenden Sie das magnetische Ende, um den Knopf zu halten und Kochsalzlösung oder PBS mit einer Ein-Milliliter-Spritze zu injizieren, die am entsprechenden Injektor befestigt ist, bis die Flüssigkeit aus dem einen französischen Ende austritt. Drücken Sie den Knopf kaudal in der Tasche und schließen Sie die Haut über der Filzscheibe der VAs unter dem Flansch des VAS mit zwei vier oh unterbrochenen Nähten kranial. Zur Venenkatheterisierung drehen Sie die Maus zurück in die Rückenlage und fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf die geschnittene Seite hinzu.
Trennen Sie die Ligaturen und binden Sie die erste Ligatur mit zwei bis drei Knoten so weit wie möglich kraniell um den Katheter und die Halsvene, um die Vene zu ligieren und den Katheter außen zu verankern. Bewegen Sie die zweite Ligatur so nah wie möglich an die Brustmuskeln. Mit einer Mikroschere schneiden Sie einen diagonalen Winkel, um ein scharfes Ende zu erzeugen, so dass drei bis fünf Millimeter des Katheters in der Vene sind.
Dann stechen Sie ein Loch in die Vene mit einer 27-Gauge-Nadel, die an einer mit Kochsalzlösung gefüllten Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, indem Sie an der gesicherten Schädelligatur ziehen und die Nadel parallel zur Vene schieben. Als nächstes führen Sie den Katheter auf die gleiche Weise in die Vene ein, indem Sie an der gesicherten Schädelligatur ziehen und den Katheter mit der gebogenen Pinzette in die Vene schieben. Drücken Sie den Katheter, bis er mit der Vene ausgerichtet ist.
Binden Sie die zweite Ligatur mit zwei bis drei Knoten über den eingeführten Katheterbereich und prüfen Sie, ob kein Blut austritt. Schneiden Sie das überschüssige Ende beider Ligaturen mit einer Mikroschere ab und fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung hinzu. Dann verschließen Sie die Haut mit 4,0 resorbierbaren unterbrochenen Nähten.
Injizieren Sie der Maus das gewünschte Volumen an Inhibitor oder PBS-Kochsalzlösung, wie zuvor gezeigt. Halten Sie den Überdruck auf den Kolben aufrecht, während Sie die Spritze vom VAS trennen. Überwachen Sie die Mäuse nach der Genesung.
Mit der Ultraschallsoftware können Sie die Einstellungen so einstellen, dass 30 DB Bildtiefe auf 9,0 Millimeter und Breite auf 8,08 Millimeter gewonnen werden. Als nächstes fügen Sie jedem der vier Elektrokardiogramme oder EKG-Elektroden auf der Bühne einen Tropfen Elektrogel hinzu und kleben die Extremitäten der Maus an sie. Verteilen Sie warmes Ultraschallgel auf den Bauch der Maus und senken Sie den Transmitter, um ihn mit dem Bauch in Kontakt zu bringen.
Identifizieren Sie die Aorta als kreisförmiges, schnell pulsierendes Gefäß. Lokalisieren Sie die linke Nierenarterie und untersuchen Sie den Bereich manuell bis zu 12 Millimeter kranial, um sicherzustellen, dass der interessierende Bereich nicht gestört wird. Rückkehr zur linken Nierenarterie.
Stellen Sie dann die Sonde auf sechs Millimeter kranial von der Arterie ab. Für die 3D-Ultraschallaufnahme stellen Sie das Atem-Gating auf 25% Verzögerung und ein Fenster von 50% und den EKG-Auslöser auf 50 Millisekunden ein. Stellen Sie aus den 3D-Optionen den Scanabstand auf 11,96 Millimeter bei einer Schrittweite von 0,076 Millimetern ein.
Scrollen Sie nach dem Erfassen von 157 Frames durch die Bildqualität, um die Bildqualität zu überprüfen, bevor Sie das Bild speichern. Für die 2D-Durchmessererfassung schalten Sie den Atem-Gating- und EKG-Auslöser aus und lokalisieren Sie manuell den Bereich mit dem größten Durchmesser im 12-Millimeter-Abschnitt der Superrenierenaorta. Drücken Sie den B-Modus auf dem Bildschirm und erfassen Sie ein Bild im B-Modus.
Zusätzlich können Sie für das EKV-Bild ohne Bewegung des Wandlers ein EKV-Bild mit den Standardeinstellungen des Systems an derselben Stelle erfassen. Die Entwicklung und das Fortschreiten der Superrenaleneurysmen wurden am achten und 27. Tag des Ausgangs durch Ultraschall überwacht. Eine trichrome Färbung der Aorta des Tages 27 veranschaulicht die Morphologie des gebildeten Aneurysmas mit Wanddissektion und intramuralem Thrombus.
Die Inzidenzrate von Bauchaortenaneurysma oder AAA am achten Tag und Aortenrupturen innerhalb der ersten neun Tage zeigte, dass 9% der Mäuse keine AAA bildeten. Bei 35% der Mäuse kam es jedoch vor der Katheterimplantation zu Aortenrupturen, so dass insgesamt 56% der verbleibenden Mäuse mit etablierter AAA-Erkrankung minimal in Behandlungsgruppen eingeteilt werden konnten. Eine umgekehrte Beziehung zwischen der anfänglichen Expansion und dem weiteren Fortschreiten der Erkrankung von anfänglich schnell bildenden versus mäßig wachsenden Aneurysmen wurde bei PBS-kontrollierten Mäusen beobachtet.
Die beispielhaften Ultraschallergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit GSK 4 84 die AAA-Progression hemmte, während sich die Aneurysmen weiter vergrößerten und Mäuse kontrollierten. Die Katheterdurchgängigkeit ist wichtig, da die Kathetertrennung von der Vene oder dem vaskulären Zugangsknopf zu einer Arzneimittelabgabe in den subkutanen Raum mit unbekannten Arzneimittelkonzentrationen an der Aneurysmastelle führt. Wenn Mäuse am Ende des Experiments geopfert werden, können das Wasser und andere Gewebe histologisch untersucht und Blutanalysen durchgeführt werden, um die Wirkungen von Zielarzneimitteln zu charakterisieren.
