Durch die Untersuchung der Funktion von Becherzellen in Primärkultur gewinnen wir wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die hinter den geschlechtsspezifischen Unterschieden in der Gesundheit der Augenoberfläche stehen. Wir haben die bereits etablierte Methode der Konjunktival-Becherzell-Primärkultur modifiziert, indem wir Hormone und östrogene Substanzen aus dem System eliminiert haben, was eine genauere Kontrolle des Sexualhormonspiegels ermöglicht. Diese Modifikation erhöht die Genauigkeit und Zuverlässigkeit unserer Ergebnisse.
Die intrazelluläre Kalziummessung ist eine Methode, um die Funktion der Becherzellen unter verschiedenen Stimuli und die intrazellulären Signalwege, die durch jeden Stimulus ausgelöst werden, zu untersuchen. Die Technik kann auf die Entwicklung von Medikamenten für Augenoberflächenerkrankungen wie Augenallergie, trockenes Auge oder Bindehautentzündung ausgeweitet werden. Diese Technik erleichtert das Screening der Wirkung verschiedener Moleküle auf Becherzellen unter bestimmten Hormonspiegeln.
Menschen, die neu in dieser Technik sind, haben oft Schwierigkeiten, Bindehautgewebe von Bindegewebe zu trennen. Wir raten Ihnen, genau auf die Textur und die Materialeigenschaften des Gewebes zu achten. Die Bindehaut sollte elastisch und halbtransparent sein, während das Bindegewebe in der Regel heller und baumwollfaserartig ist.
Zerkleinern Sie zunächst mit einem sterilen Skalpell das menschliche Bindehautgewebe in einen Millimeter große Stücke. In einer Sechs-Well-Platte werden vier Stücke in jede Vertiefung eingesät, die einen Millimeter des vollständigen RPMI-Mediums enthalten. Achte darauf, die Teile auf dem Teller zu verankern.
Inkubieren Sie die Gewebestücke bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft. Aktualisieren Sie das Nährmedium jeden zweiten Tag. Nach 72 Stunden nach der Aussaat wird der Gewebepfropfen entfernt und die Inkubation fortgesetzt, bis die Becherzellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht haben.
Als nächstes spülen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie 0,05 % Trypsin EDTA hinzu, um die Zellen vom Boden der Platte zu lösen. Beobachten Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Und sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie ein vollständiges RPMI-Medium hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 150 g und resuspendieren Sie das Pellet in phenolrotfreiem RPMI-Medium. Anschließend wird die Zellsuspension zur Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration erneut auf eine Kulturschale mit Glasboden gesetzt. Für die Beladung mit Fura-2 AM wird Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer mit 0,5 % HEPES, 0,5 % BSA und 0,5 Mikromolar Fura-2 AM, acht mikromolare Pluronsäure F127 und 250 Mikromol Sulfinpyrazon in die Glasbodenschale mit den Becherzellen gegeben.
Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und schützen Sie sie so vor Licht. Nach der Inkubation werden die Zellen mit Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer gewaschen, der 250 mikromolare Sulfinpyrazon enthält. Zur Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration wird die Schale mit den mit Fura-2 beladenen Zellen unter das Mikroskop gelegt.
Fügen Sie dann die 200-fache Vergrößerung hinzu. Suchen Sie ein repräsentatives Feld mit 20 bis 50 Zellen. Zeichnen Sie mit der Freihandfunktion einen Umriss um jede Zelle, um sie von der Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden, und warten Sie, bis die Software die Hintergrundfluoreszenz automatisch von der Messung abzieht.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Experiment starten" und warten Sie acht bis 15 Sekunden, um den Kalziumspiegel in den Zellen zu bestimmen. Fügen Sie dann vorsichtig den cholinergen Agonisten Carbachol hinzu und messen Sie mindestens 120 Sekunden lang oder bis der Kalziumspiegel wieder auf den Ausgangswert zurückgekehrt ist. Berechnen Sie anhand der Änderung der intrazellulären Kalziumkonzentration den mittleren basalen Kalziumspiegel in jeder Zelle aus den ersten acht bis 15 Sekunden der Messungen.
Entfernen Sie Zellen mit einem mittleren basalen Kalziumspiegel von 500 Nanomolar oder mehr aus dem Datensatz. Berechnen Sie als Nächstes die maximale intrazelluläre Kalziumkonzentration für jede Zelle. Subtrahieren Sie dann den basalen Kalziumspiegelwert von der maximal gemessenen intrazellulären Konzentration für dieselbe Zelle.
Zum Schluss wird die Änderung der maximalen intrazellulären Kalziumkonzentration für alle Zellen in einer Schale gemittelt. Die Reinheit menschlicher Bindehautbecherzellen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt, wobei Antikörper verwendet wurden, die spezifisch für die Becherzellmarker Zytokeratin und Helix pomatia Lektin 1 waren. Die Ergebnisse des Fura-2 AM-Assays zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen Zellen, die in phenolrotfreiem RPMI mit 1 % BSA und vollständigem RPMI-Medium inkubiert wurden.
Es wurde jedoch ein signifikanter Anstieg der intrazellulären Kalziumantwort auf Carbachol beobachtet, wenn die fortgeschrittene RPMI-Medium-Gruppe mit der vollständigen RPMI-Medium-Gruppe verglichen wurde. Das Wichtigste ist, eine primäre menschliche Kelchzellkultur mit ausreichender Zelldichte zu erhalten. Stellen Sie während des Wachstums sicher, dass die Gewebestücke an der Kulturplatte haften, um ein effektives Wachstum zu erzielen.
Die Forscher konnten die Beteiligung bestimmter Signalwege untersuchen, indem sie verschiedene Hemmstoffe, gezielte Rezeptoren oder Signalmoleküle an die Zellen vor der Stimulation anwendeten. Die anderen Parameter, die auf die Funktion der Becherzellen hinweisen, wie die Muzinsekretion und die Deaktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, können ebenfalls beurteilt werden. Die komplementären Messungen liefern ein umfassendes Verständnis der Reaktion der Becherzellen auf verschiedene Reize.
