Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Bestimmung der S-Phasendauer in synchronisierten Knospungshefezellen. Es ist eine schnelle, einfache und reproduzierbare Methode. Darüber hinaus ist es empfindlich genug, um leichte Synthesedefekte zu erkennen, die von klassischen Protokollen nicht erkannt werden.
Diese Methode wird für viele Forscher nützlich sein, die an der Regulation des Zellzyklus in knospenden Hefen arbeiten. Dieses Protokoll wird von Nicolas Talarek, einem leitenden Forscher, und Juan De Dios Barba Tena, einem Doktoranden im Labor, demonstriert. Impfen Sie Saccharomyces cerevisiae-Zellen in 10 Milliliter SC-Medium bei niedriger Zellkonzentration für eine Nachtkultur bei 30 Grad Celsius mit orbitaler Bewegung bei 130 Umdrehungen pro Minute.
Am nächsten Tag verdünnen Sie die Zellen in 20 Milliliter frischem SC-Medium in einer Endkonzentration von zwei- bis dreimal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter. Bei 40 Mikrolitern von einem Milligramm pro Milliliter Alpha-Faktor in Wasser verdünnt. Dann kultivieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius, mit orbitaler Bewegung bei 130 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde.
Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Visualisieren Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um den G1-Arrest zu überwachen. Fahren Sie fort, wenn mehr als 90 % der Zellen einen Shmoo aufweisen und die anderen gerundeten, nicht abgerundeten Zellen sind.
Zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 1.500 G.Dann verwerfen Sie den Überstand mit der Vakuumpipette und resuspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliter SC-Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Sammeln Sie zweimal alle fünf Minuten einen Milliliter Zellen und fahren Sie mit der EDU-Markierung fort.
Fügen Sie 30 Minuten nach der Freisetzung 400 Mikroliter des Alpha-Faktors hinzu. Einen Milliliter der Zellkultur wird in ein Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen überführt, das einen Mikroliter 10 Millimolar EDU enthält, gut gemischt durch Inversion. Um die EDU-positiven Zellen von den EDU-negativen Zellen anhand einer bivarianten Pi-EDU-Tatsache zu unterscheiden, wird ein weiterer Milliliter Zellkultur in ein Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen übertragen, das einen Mikroliter DMSO enthält.
Drei bis fünf Minuten bei 30 Grad Celsius unter Rühren in einem schüttelnden Wasserbad inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter 100% Ethanol hinzufügen. Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrofuge.
Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter 70% Ethanol und mischen Sie es gut durch Wirbeln. Lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur bei 20 Neigungen pro Minute auf einer Wippe mit variabler Geschwindigkeit, um die Zellen zu permeablizieren.
Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrozentrifuge und entsorgen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 Mikrolitern 10% Ethanol und PBS. Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrofuge und entsorgen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette.
Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern PBS, das RNase A und Proteinase K enthält.Inkubieren Sie ein bis zwei Stunden bei 50 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln oder über Nacht bei 37 Grad Celsius. Pelletieren Sie die Zellen für zwei Minuten bei 10.000 G in einer Mikrozentrifuge und verwerfen Sie den Überstand mit einer Vakuumpipette. Waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern PBS.
Dann pelletieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter PBS mit 1% BSA. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Dann pelletieren Sie die Zellen, verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt, und resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikroliter PBS mit 1% BSA. Verteilen Sie die Zellen auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die erste sollte aus 200 Mikrolitern Zellkultur für die Click-Reaktion bestehen, und die zweite Röhre sollte 100 Mikroliter Zellkultur für die sytoxgrüne Färbung enthalten.
Dann pelletieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Für die sytoxgrüne Färbung resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikroliter PBS. Dann werden je nach Zellkonzentration 10 bis 30 Mikroliter in ein Durchflusszytometerröhrchen mit 300 Mikrolitern Sytox-Grünmischung überführt.
Die Proben zweimal für zwei Sekunden bei einer Amplitude von 40 bis 50% beschallenLassen Sie sie im Dunkeln, bis die Proben auf einem Durchflusszytometer verarbeitet werden. Für die Click-Reaktion resuspendieren Sie das Zellpellet mit 40 Mikrolitern frisch zubereitetem Azid-Farbstoffpuffer. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 60 Minuten inkubieren.
Pelletieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 300 Mikrolitern 10% Ethanol in PBS. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern von 50 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid in PBS und lassen Sie sie für 10 Minuten im Dunkeln.
Je nach Zellkonzentration werden 10 bis 30 Mikroliter der Zellsuspension in ein Durchflusszytometerröhrchen überführt, das 300 Mikroliter 50 Millimolar Tris HCl, pH 7,5 enthält. Schneiden Sie zweimal für zwei Sekunden bei einer Amplitude von 40 bis 50. Lassen Sie die Proben im Dunkeln, bis sie auf einem Zytometer verarbeitet werden.
Lesen Sie die sytoxgrünen Proben mit einem blauen Anregungslaser bei 488 Nanometern und einem 530 x 30 Bandpassfilter. Lesen Sie die Bavaria Pi EDU-Beispiele in einem Punktdiagramm mit einem blauen Anregungslaser bei 488 Nanometern und einem 615 x 20-Bandpassfilter für die Pi-X-Achse und einem roten Anregungslaser bei 640 Nanometern, einem 660 x 20-Bandpassfilter für die Y-Achse. Drei Zellpopulationen wurden in der bivarianten EDU-Pi-Zytometer-Analyse beobachtet.
Bei 25 Grad Celsius befanden sich etwa 27% der Zellpopulation in der G1-Phase, 29% in der S-Phase und etwa 44% in der G2 plus M-Phase. In synchronisierten Zellen kann die Dauer der S-Phase etwa 25 Minuten betragen, basierend auf der Zeit, in der sich der DNA-Gehalt auf dem Sytox-Green-Flow-Zytometer-Profil von einem C auf zwei C geändert hat. Die EDU-Pulsmarkierung bestimmte genau die S-Phasendauer.
15 Minuten nach der Freisetzung wurde ein Bruchteil der EDU-positiven Zellen nachgewiesen, was auf den Beginn der S-Phase hinweist. Der Verlauf durch die S-Phase wurde durch die Zellwolke gesehen, die sich im Bavaria Pi EDU-Diagramm nach oben und rechts bewegte. Schließlich, 35 Minuten nach der Freisetzung, war ein Bruchteil der Zellen EDU-negativ, aber mit der doppelten Menge an DNA, was darauf hindeutet, dass die S-Phase endete und die Zellen in der G2 plus M-Phase waren.
Trotz der beobachteten hohen Synchronität beendeten einige Zellen die S-Phase 60 Minuten nach der Freisetzung und die S-Phase war für die gesamte Population etwa 65 Minuten nach der Freisetzung abgeschlossen. Es ist entscheidend, eine perfekte Synchronisation zu haben und zu verhindern, dass Zellen in die zweite S-Phase eintreten. Zellen können mit einem Mikroskop abgebildet werden, wo die Vorausschau der Kern-DNA-Replikation überwacht und quantifiziert werden kann.
Diese Technik wird helfen, Übersehene Mutanten zu identifizieren, die leichte S-Phasendefekte sowie Zellzyklusdauerdefekte aufweisen.
