Ce protocole peut être mis en œuvre dans la plupart des laboratoires de biologie du développement de l’œsophage, ce qui permet aux chercheurs qui n’ont pas accès à des microscopes à super résolution de produire des images à super résolution. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs de contourner la limite de diffraction de la microscopie confocale conventionnelle sans avoir besoin d’un microscope à super résolution en élargissant l’échantillon lui-même. Ce protocole sera bénéfique pour ceux qui étudient comment la localisation des protéines affecte la morphologie ou la fonction cellulaire dans les embryons intacts, en particulier lorsque ces protéines sont organisées en structures ou réseaux subcellulaires complexes.
Le problème le plus courant que les gens rencontrent est la perte d’embryons tout au long du protocole. Il est conseillé d’appliquer plusieurs couches de Poly-L-Lysine pour faire adhérer fermement les embryons. Après les embryons, prenez une base de boîte de Pétri en plastique de six centimètres remplie à moitié d’agar-agar à 3%.
Marquez un rectangle de cinq centimètres sur trois dans l’agar avec une lame de rasoir ou un scalpel. Retirez la plaque de gélose à l’aide d’une petite spatule de laboratoire. Retournez ensuite la base de la boîte de Pétri, placez-la sur le banc et placez la plaque de gélose sur le dessus de la boîte inversée.
Retirez le couvercle de la boîte de Pétri et assurez-vous qu’il est sec. À l’aide de gants, fixez un morceau de ruban adhésif double face à l’intérieur du couvercle. Sortez les flacons contenant les embryons enrobés et fixés du shaker et placez-les verticalement sur l’établi.
Laisser les phases organique et aqueuse se séparer. Les embryons correctement fixés doivent rester à leur interface. Retirez complètement la phase aqueuse inférieure à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une pipette P200.
À l’aide d’une pipette Pasteur en verre munie d’une poire en latex, transférer les embryons fixés sur une plaquette de gélose en plusieurs petits lots afin qu’ils n’adhèrent pas à l’intérieur de la pipette. Une fois que les embryons sont sur la plaque de gélose, utilisez une pipette P200 pour retirer tout heptane restant près des embryons. Maintenant, déposez le couvercle du ruban adhésif double face sur la dalle de gélose d’une hauteur de deux centimètres pour faire adhérer les embryons au ruban.
Retirez délicatement le couvercle de la dalle de gélose, placez-le à l’envers sur la paillasse et ajoutez suffisamment de PBS Tween pour couvrir les embryons dans le couvercle. Pour prélever les embryons souhaités, utilisez un microscope à dissection stéréoscopique à grossissement de 100x avec éclairage indirect. Piquez la membrane vitelline près de l’extrémité antérieure ou postérieure de l’embryon avec une fine aiguille de verre pour la dégonfler et relâcher la pression.
À l’aide d’une pince fine ou d’une sonde métallique, poussez doucement l’embryon à travers le trou avec la membrane vitelline encore collée au ruban adhésif double face. Laissez les embryons non désirés sur le ruban. Utiliser périodiquement une pipette Pasteur en verre pour recueillir tout embryon devitellinisé flottant et le déplacer dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre.
Préparez la solution PDMS dans un tube conique de 50 millilitres et créez un tube équilibré en ajoutant une quantité appropriée d’eau à un deuxième tube conique de 50 millilitres. Centrifugez la solution PDMS à 500 G pendant trois minutes à 15 degrés Celsius. Versez-le ensuite dans une boîte de Pétri de 10 centimètres à une profondeur d’un millimètre.
Laissez la solution PDMS se solidifier pendant la nuit à 55 degrés Celsius. Une fois la dalle PDMS solidifiée, marquez des zones carrées légèrement plus petites qu’une lamelle de 22 x 22 millimètres à l’aide d’un scalpel. À l’intérieur de chaque carré, entaillez et retirez un puits carré de huit millimètres de large.
transférez chaque puits PDMS carré sur une lamelle de 22 x 22 millimètres et collez-la fermement. Pour faire adhérer les embryons aux lamelles de couverture, appliquez suffisamment de poly-L-lysine à 0,1 % pour couvrir la surface de la lamelle de couverture à l’intérieur de chaque puits et placez-les dans un incubateur à 55 degrés Celsius pour les faire sécher. Rincez brièvement les embryons et le PBS pour éliminer le détergent pour préadolescents.
Ensuite, transférez plus de 10 embryons dans chaque puits enrobé de Poly-L-Lysine. Laissez les embryons s’installer au fond des puits. Retirez l’excès de liquide des embryons collés à l’aide d’une pipette Pasteur et passez immédiatement à l’étape suivante.
Pendant que les embryons reposent dans la solution de monomère, préparez une solution gélifiante pour couvrir les puits du PDMS. Diluez l’oxydant catalytique fraîchement extrait de la poudre. Combinez 3 920 microlitres de solution monomère avec 60 microlitres de 10 % TEMED et 20 microlitres de 1 % de TEMPO.
Divisez la solution de gélification en aliquotes de 125 microlitres en plusieurs tubes PCR. Retirer la solution de monomère des puits PDMS à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette en prenant soin de ne pas perturber les embryons. Ajoutez cinq microlitres d’APS à l’un des tubes PCR contenant une solution gélifiante pour initier la polymérisation.
Répartissez rapidement la solution gélifiante polymérisante entre les trois puits. Répétez cette opération jusqu’à ce que tous les puits et embryons soient couverts. Laissez les échantillons se gélimer pendant 1,5 à 2,5 heures à 37 degrés Celsius.
Les hydrogels plus épais mettront plus de temps à terminer la polymérisation et à se solidifier. Agitez souvent les hydrogels pour surveiller la polymérisation. Une fois solidifiés, les hydrogels ne bougent pas.
Après la gélification, décollez les puits PDMS de la lamelle de recouvrement sans perturber les hydrogels. Transférez les hydrogels individuellement dans les puits d’une plaque à six puits. Les hydrogels peuvent se dilater légèrement pendant la digestion.
Recouvrez complètement les gels d’un tampon de digestion. 30 millilitres de tampon de digestion suffisent pour les recouvrir d’une plaque à six puits et les incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après la digestion, déplacez les hydrogels dans une boîte de Pétri de six centimètres et remplissez-la d’eau déminéralisée pour qu’elle se dilate.
Les hydrogels peuvent se détacher des lamelles de recouvrement à ce stade et se dilater quatre fois en dimension linéaire. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirez autant d’eau que possible de la boîte de Pétri afin de minimiser le mouvement des gels lorsqu’ils sont manipulés. Manœuvrez les gels expansés avec les embryons sur la surface inférieure sur une grande lamelle de recouvrement pour l’imagerie.
Montez chaque lamelle de recouvrement avec du gel sur l’objectif d’un microscope confocal à balayage laser inversé. Après avoir localisé les spécimens correctement mis en scène et orientés, passez à un objectif à immersion dans l’huile ou l’eau à fort grossissement pour obtenir une image à haute résolution. La mesure de la longueur de l’embryon le long de l’axe tête-queue sous un objectif 10x a montré que les embryons non expansés couvraient environ la moitié d’un champ de vision, tandis que les embryons expansés couvraient environ deux champs de vision complets.
La longueur moyenne de la tête à la queue des embryons témoins non expansés était de 398,8 micromètres. Pour les expériences un, deux et trois, les longueurs moyennes des embryons étaient des facteurs d’expansion de 4,0 fois, 4,7 fois et 4,9 fois respectivement. Dans l’échantillon témoin, les cellules du segment maxillaire avaient une largeur moyenne de 4,76 micromètres.
Dans les échantillons élargis, les cellules du segment maxillaire avaient une largeur moyenne de 19,10 micromètres, ce qui représente une expansion de 4,0 fois. Le cytosquelette de l’actomyosine a été imagé chez des embryons témoins non expansés par rapport à des embryons expansés, subissant une extension convergente. Ils apparaissaient comme une seule ligne où les cellules voisines se rencontraient.
En revanche, dans les embryons de stade sept élargi, des lignées parallèles de myosine deux ont pu être observées aux jonctions cellulaires, représentant des pools de protéines corticales dans les cellules adjacentes. Dans les embryons non expansés de stade six, les mitochondries marquées avec la streptavidine sont apparues sous la forme d’un voile cytoplasmique hétérogène sans aucun détail subcellulaire clair. Cependant, dans les embryons expansés, de nombreux puncta étaient solubles dans le cytoplasme, représentant probablement des mitochondries fragmentées ou des parties du réseau mitochondrial.
Une chose importante à retenir lors de cette procédure est de protéger les embryons d’une exposition excessive à la lumière après l’incubation secondaire des anticorps.
