Этот протокол может быть реализован в большинстве лабораторий биологии развития пищевода, позволяя исследователям, не имеющим доступа к микроскопам сверхвысокого разрешения, получать изображения сверхвысокого разрешения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет исследователям обойти дифракционный предел обычной конфокальной микроскопии, не требуя микроскопа сверхвысокого разрешения, за счет расширения самого образца. Этот протокол будет полезен для тех, кто изучает, как локализация белка влияет на морфологию или функцию клеток в интактных эмбрионах, особенно когда эти белки организованы в сложные субклеточные структуры или сети.
Наиболее распространенной проблемой, с которой сталкиваются люди, является потеря эмбрионов на протяжении всего протокола. Рекомендуется нанести несколько слоев поли-L-лизина, чтобы эмбрионы прочно прилипли. После эмбрионов возьмите шестисантиметровую пластиковую основу чашки Петри, наполовину заполненную 3%-ным агаром.
Нарежьте прямоугольник размером пять на три сантиметра в агаре лезвием бритвы или скальпелем. Удалите агаровую плиту с помощью небольшого лабораторного шпателя. Затем переверните основание чашки Петри, установите его на скамью и положите пластину агара поверх перевернутой чашки.
Снимите крышку с чашки Петри и убедитесь, что она сухая. С помощью перчаток прикрепите кусок двустороннего скотча к внутренней стороне крышки. Выньте флаконы с покрытыми оболочкой и зафиксированными эмбрионами из шейкера и поместите их вертикально на верстак.
Дайте органической и водной фазам разделиться. Правильно зафиксированные эмбрионы должны оставаться на своем стыке. Полностью удалите нижнюю водную фазу с помощью пипетки Пастера и пипетки P200.
Используйте стеклянную пипетку Пастера с латексной колбой для переноса фиксированных эмбрионов на агаровую пластину несколькими небольшими партиями, чтобы они не прилипали к внутренней части пипетки. После того, как эмбрионы окажутся на агаровой плите, используйте пипетку P200, чтобы удалить оставшийся гептан рядом с эмбрионами. Теперь опустите крышку из двустороннего скотча на агаровую плиту с высоты двух сантиметров, чтобы приклеить эмбрионы к ленте.
Осторожно снимите крышку с агаровой плиты, положите ее вверх дном на стол и добавьте достаточное количество PBS Tween, чтобы покрыть эмбрионы в крышке. Для сбора нужных эмбрионов используют стерео препарирующий микроскоп при 100-кратном увеличении при непрямом освещении. Проколите вителлиновую оболочку возле переднего или заднего конца эмбриона тонкой стеклянной иглой, чтобы сдуть ее и ослабить давление.
Используйте тонкие щипцы или металлический зонд, чтобы осторожно вытолкнуть эмбрион через отверстие, при этом вителлиновая мембрана все еще приклеена к двустороннему скотчу. Оставьте на ленте нежелательные эмбрионы. Периодически используйте стеклянную пипетку Пастера, чтобы собрать все плавающие девителлинизированные эмбрионы и переместить их в 1,5-миллилитровую пробирку для микрофуги.
Приготовьте раствор PDMS в конической пробирке объемом 50 миллилитров и создайте сбалансированную пробирку, добавив соответствующее количество воды во вторую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте раствор PDMS при 500G в течение трех минут при температуре 15 градусов Цельсия. Затем перелейте его в 10-сантиметровую чашку Петри на глубину одного миллиметра.
Дайте раствору PDMS затвердеть в течение ночи при температуре 55 градусов по Цельсию. После того, как плита PDMS затвердеет, нарежьте скальпелем квадратные площади немного меньше, чем покровное покрытие размером 22 на 22 миллиметра. Внутри каждого квадрата надрежьте и выньте квадрат шириной восемь миллиметров.
Перенесите каждый квадрат PDMS на покровное покрытие размером 22 на 22 мм и прочно приклейте его. Чтобы приклеить эмбрионы к покровным стеклам, нанесите достаточное количество 0,1% поли-L-лизина, чтобы покрыть поверхность покровного стекла внутри каждой лунки, и поместите их в инкубатор с температурой 55 градусов Цельсия для сушки. Коротко промойте эмбрионы и PBS, чтобы удалить моющее средство для подростков.
Затем перенесите более 10 эмбрионов в каждую лунку, покрытую поли-L-лизином. Дайте эмбрионам осесть на дно лунок. Удалите лишнюю жидкость из прилипших эмбрионов с помощью пипетки Пастера и сразу приступайте к следующему этапу.
Пока эмбрионы находятся в растворе мономера, приготовьте раствор гелеобразования, чтобы покрыть лунки PDMS. Разведите каталитический окислитель свежим из порошка. Смешайте 3 920 микролитров раствора мономера с 60 микролитрами 10%-ного TEMED и 20 микролитрами 1%-ного TEMPO.
Раствор гелеобразования разделить на аликвоты по 125 микролитров на несколько пробирок для ПЦР. Удалите раствор мономера из лунок PDMS с помощью вакуума или пипетки, стараясь не повредить эмбрионы. Добавьте пять микролитров APS в одну из пробирок для ПЦР, содержащую раствор гелеобразования, чтобы инициировать полимеризацию.
Быстро распределите полимеризующий раствор гелеобразования между тремя лунками. Повторяйте это до тех пор, пока все лунки и эмбрионы не будут покрыты. Дайте образцам застудиться в течение 1,5-2,5 часов при температуре 37 градусов по Цельсию.
Более густым гидрогелям потребуется больше времени для полной полимеризации и затвердевания. Часто перемешивайте гидрогели, чтобы контролировать полимеризацию. После затвердевания гидрогели не будут шевелиться.
После гелеобразования отклейте лунки PDMS от покровного шликера, не повредив гидрогели. Переместите гидрогели по отдельности в лунки шестилуночной пластины. Гидрогели могут немного расширяться во время пищеварения.
Полностью покройте гели пищеварительным буфером. 30 миллилитров пищеварительного буфера достаточно, чтобы покрыть их шестилуночной тарелкой и инкубировать в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. После разложения переместите гидрогели в шестисантиметровую чашку Петри и наполните ее деионизированной водой для расширения.
В этой точке гидрогели могут отсоединиться от покровных скольжений и развернуться на четыре складки в линейном размере. С помощью пипетки Пастера удалите как можно больше лишней воды из чашки Петри, чтобы свести к минимуму движение гелей при обращении. Переместите расширенные гели с эмбрионами на нижнюю поверхность на большой покровный лист для визуализации.
Наклейте каждую крышку с гелем на объектив инвертированного лазерного сканирующего конфокального микроскопа. После определения местоположения правильно расположенных и ориентированных образцов переключаются на масляный или водопогружающий объектив с большим увеличением для получения изображения с высоким разрешением. Измерение длины эмбриона вдоль оси головы до хвоста под 10-кратным объективом показало, что нерасширенные эмбрионы охватывают примерно половину поля зрения, в то время как расширенные эмбрионы охватывают примерно два полных поля зрения.
Средняя длина головы до хвоста нерасширенных контрольных эмбрионов составила 398,8 мкм. Для первого, второго и третьего экспериментов средняя длина эмбриона была коэффициентом экспансии в 4,0, 4,7 и 4,9 раза соответственно. В контрольной выборке клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 4,76 мкм.
В расширенных образцах клетки верхнечелюстного сегмента имели среднюю ширину 19,10 мкм, что представляет собой расширение в 4,0 раза. Цитоскелет актомиозина был визуализирован в нерасширенном контроле по сравнению с расширенными эмбрионами, подвергающимися конвергентному расширению. Они выглядели как единая линия, где сходились соседние клетки.
Напротив, у эмбрионов седьмой стадии на расширенной стадии можно было наблюдать параллельные линии миозина 2 в клеточных соединениях, представляющие собой пулы кортикальных белков в соседних клетках. У нерасширенных эмбрионов шестой стадии митохондрии, меченные стрептавидином, выглядели как гетерогенная цитоплазматическая дымка без каких-либо четких субклеточных деталей. Тем не менее, у расширенных эмбрионов в цитоплазме можно было разрешать многочисленные пункты, которые, вероятно, представляли собой фрагментированные митохондрии или части митохондриальной сети.
Одна важная вещь, которую следует помнить при попытке выполнить эту процедуру, - это защита эмбрионов от чрезмерного воздействия света после инкубации вторичных антител.
