このプロトコルは、ほとんどの食道発生生物学研究室で実施できるため、超解像顕微鏡にアクセスできない研究者でも超解像画像を作成できます。この技術の主な利点は、研究者がサンプル自体を拡大することで、超解像顕微鏡を必要とせずに従来の共焦点顕微鏡の回折限界をバイパスできることです。このプロトコルは蛋白質のローカリゼーションが細胞形態にいかに影響するか、またはそれらの蛋白質が複雑な細胞下構造かネットワークに組織されるとき、無傷の胚の機能をいかに調査するか調査するそれらのために有利である。
人々が遭遇する最も一般的な問題は、プロトコル全体で胚を失うことです。胚をしっかりと接着させるために、ポリ-L-リジンを複数回塗布することをお勧めします。胚の後、半分に3%寒天を詰めた6センチメートルのプラスチック製のペトリ皿ベースを取ります。
寒天に5×3センチの長方形をカミソリの刃またはメスで切り込みを入れます。小さなラボスパチュラを使用して寒天スラブを取り除きます。次に、ペトリ皿の底をひっくり返してベンチに置き、逆さにした皿の上に寒天スラブを置きます。
ペトリ皿から蓋を外し、乾いていることを確認します。手袋をして、蓋の内側に両面テープを貼ります。コーティングされた固定された胚を含むバイアルをシェーカーから取り出し、作業台に垂直に置きます。
有機相と水相を分離します。適切に固定された胚は、それらのインターフェースにとどまる必要があります。PasteurピペットとP200ピペットを使用して、下部の水相を完全に除去します。
ラテックスバルブを取り付けたガラス製のパスツールピペットを使用して、固定された胚を複数の小さなバッチで寒天スラブに移し、ピペットの内側に付着しないようにします。胚が寒天スラブ上に配置されたら、P200ピペッターを使用して、胚の近くに残っているヘプタンを取り除きます。次に、両面テープの蓋を2センチの高さから寒天スラブに落とし、胚をテープに接着します。
寒天スラブから蓋をそっと取り外し、ベンチに逆さまに置き、蓋の胚を覆うのに十分なPBS Tweenを追加します。目的の胚を採取するには、間接照明で100倍の倍率の実体解剖顕微鏡を使用します。胚の前端または後端近くの硝子膜を細いガラス針で刺して収縮させ、圧力を解放します。
細かい鉗子または金属プローブを使用して、ビテリン膜を両面テープに接着したまま、胚を穴からそっと押し出します。望ましくない胚をテープに残します。定期的にガラス製のパスツールピペットを使用して、浮遊するデビテリン化胚を採取し、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。
50ミリリットルのコニカルチューブでPDMS溶液を調製し、2本目の50ミリリットルのコニカルチューブに適切な量の水を加えてバランスの取れたチューブを作成します。PDMS溶液を500Gで摂氏15度で3分間遠心分離します。次に、それを10センチメートルのシャーレに1ミリメートルの深さまで注ぎます。
PDMS溶液を摂氏55度で一晩固化させます。PDMSスラブが固まったら、メスを使用して22 x 22ミリメートルのカバースリップよりわずかに小さい正方形の領域にスコアを付けます。各正方形の内側に、幅8ミリメートルの正方形の井戸に切り込みを入れて取り除きます。
正方形のPDMSを22 x 22 mmのカバースリップによく移し、しっかりと接着します。胚をカバースリップに付着させるには、各ウェル内のカバースリップ表面を覆うのに十分な0.1%ポリ-L-リジンを塗布し、摂氏55度のインキュベーターに入れて乾燥させます。胚とPBSを簡潔にすすぎ、Tween界面活性剤を取り除きます。
次に、10個以上の胚を各ポリ-L-リジンコーティングウェルに移植します。胚が井戸の底に落ち着くのを待ちます。パスツールピペットを使用して接着した胚から余分な液体を取り除き、すぐに次のステップに進みます。
胚をモノマー溶液中に置いて、PDMSウェルを覆うゲル化溶液を調製します。触媒酸化剤を粉末から新たに希釈します。3、920マイクロリットルの単量体溶液を60マイクロリットルの10%TEMEDおよび20マイクロリットルの1%TEMPOと組み合わせます。
ゲル化溶液を125マイクロリットルのアリコートで複数のPCRチューブに分割します。胚を破壊しないように注意しながら、真空またはピペッターを使用してPDMSウェルからモノマー溶液を除去します。ゲル化溶液が入ったPCRチューブの1つに5マイクロリットルのAPSを加えて重合を開始します。
重合ゲル化溶液を3つのウェルに素早く分配します。すべてのウェルと胚が覆われるまでこれを繰り返します。サンプルを摂氏37度で1.5〜2.5時間ゲル化させます。
厚いハイドロゲルは、重合が完了して固化するのに時間がかかります。ヒドロゲルを頻繁に攪拌して重合を監視します。一度固まると、ハイドロゲルは小刻みに揺れません。
ゲル化後、ハイドロゲルを乱すことなく、カバースリップからPDMSウェルを剥離します。ヒドロゲルを6ウェルプレートのウェルに個別に移します。ヒドロゲルは消化中にわずかに膨張することがあります。
ゲルを消化バッファーで完全に覆います。30ミリリットルの消化バッファーは、それらを6ウェルプレートで覆い、摂氏37度で1時間インキュベートするのに十分です。消化後、ハイドロゲルを6センチメートルのシャーレに移し、脱イオン水で満たして膨張させます。
ハイドロゲルは、この時点でカバースリップから剥離し、線寸法で4つの折り目が広がる可能性があります。パスツールピペットを使用して、ペトリ皿から余分な水分をできるだけ取り除き、取り扱い時のゲルの動きを最小限に抑えます。底面に胚がある膨張ゲルを、イメージング用の大きなカバースリップに操作します。
各カバースリップをゲルで倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡の対物レンズに取り付けます。適切にステージングされ、配向された標本を見つけた後、高倍率の油浸対物レンズまたは水浸対物レンズに切り替えて、高解像度で画像化します。10倍の対物レンズの下で頭から尾の軸に沿った胚の長さを測定したところ、拡張されていない胚は視野の約半分に広がっていたのに対し、拡張された胚は約2つの完全な視野に広がっていました。
未増殖の対照胚の平均頭部から尾部までの長さは398.8マイクロメートルであった。実験1、2、3では、平均胚長はそれぞれ4.0倍、4.7倍、4.9倍の膨張係数であった。対照サンプルでは、上顎セグメントの細胞の平均幅は4.76マイクロメートルでした。
拡大したサンプルでは、上顎セグメントの細胞の平均幅は19.10マイクロメートルで、4.0倍の膨張を表しています。アクトミオシン細胞骨格は、収斂伸長を受けた非拡張対照と増殖胚で画像化されました。それらは、隣接する細胞が出会う単一の線として現れました。
対照的に、拡大した第7期の胚では、ミオシン2の平行線が細胞細胞の接合部に観察され、隣接する細胞の皮質タンパク質プールを表しています。未増殖期の6胚では、ストレプトアビジンで標識されたミトコンドリアは、細胞内の詳細が明瞭でない不均一な細胞質ヘイズとして現れた。しかし、増殖した胚では、多数の点状点が細胞質内で解消可能であり、断片化されたミトコンドリアまたはミトコンドリアネットワークの一部を表している可能性があります。
この手順を試みる際に覚えておくべき重要なことの1つは、二次抗体のインキュベーション後に胚を過度の光曝露から保護することです。
