פרוטוקול זה יכול להיות מיושם ברוב מעבדות הביולוגיה ההתפתחותית של הוושט, ומאפשר לחוקרים שאין להם גישה למיקרוסקופים ברזולוציית על להפיק תמונות ברזולוציית על. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לעקוף את גבול העקיפה של מיקרוסקופ קונפוקלי קונקונבנציונלי ללא צורך במיקרוסקופ ברזולוציית על על ידי הרחבת הדגימה עצמה. פרוטוקול זה יועיל לאלה החוקרים כיצד לוקליזציה של חלבונים משפיעה על המורפולוגיה של התא או על תפקודו בעוברים שלמים, במיוחד כאשר חלבונים אלה מאורגנים במבנים תת-תאיים מורכבים או ברשתות.
הבעיה הנפוצה ביותר שאנשים נתקלים בה היא אובדן עוברים לאורך כל הפרוטוקול. מומלץ להחיל מעילים מרובים של פולי-L-ליזין כדי להדביק את העוברים בחוזקה. לאחר העוברים יש לקחת בסיס צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר שישה ס"מ המלא בחציו ב-3% אגר.
ציון מלבן חמישה על שלושה סנטימטרים באגר עם סכין גילוח או אזמל. מוציאים את לוח האגר בעזרת מרית מעבדה קטנה. לאחר מכן הופכים את בסיס צלחת הפטרי, מניחים אותה על הספסל ומניחים את לוח האגר על גבי הצלחת ההפוכה.
הסירו את המכסה מצלחת הפטרי וודאו שהוא יבש. בעזרת כפפות, הדביקו פיסת סרט דו-צדדי לחלק הפנימי של המכסה. הוציאו את הבקבוקונים המכילים את העוברים המצופים והקבועים מהשייקר והניחו אותם במאונך על שולחן העבודה.
אפשרו לשלב האורגני ולשלב המימי להיפרד. עוברים קבועים כראוי צריכים להישאר בממשק שלהם. הסר לחלוטין את הפאזה המימית התחתונה באמצעות פיפטת פסטר ופיפטה P200.
השתמשו בפיפטת פסטר מזכוכית המצוידת בנורת לטקס כדי להעביר את העוברים הקבועים על לוח אגר במספר אצוות קטנות, כך שלא יידבקו לחלק הפנימי של הפיפטה. ברגע שהעוברים נמצאים על לוח האגר, השתמש בפיטר P200 כדי להסיר את כל הפטן שנותר ליד העוברים. כעת, שחררו את מכסה הסרט הדו-צדדי על לוח האגר מגובה של שני סנטימטרים כדי להדביק את העוברים לקלטת.
הסירו בעדינות את המכסה מלוח האגר, הניחו אותו הפוך על הספסל והוסיפו מספיק PBS Tween כדי לכסות את העוברים במכסה. כדי לאסוף את העוברים הרצויים, השתמש במיקרוסקופ מנתח סטריאו בהגדלה של פי 100 עם תאורה עקיפה. דוקרים את קרום הוויטלין ליד הקצה הקדמי או האחורי של העובר עם מחט זכוכית עדינה כדי לנפח אותו ולשחרר לחץ.
השתמש במלקחיים עדינים או בבדיקה מתכתית כדי לדחוף בעדינות את העובר החוצה דרך החור כאשר קרום ויטלין עדיין דבוק לסרט הדו-צדדי. השאירו עוברים לא רצויים על הקלטת. מעת לעת להשתמש פיפטה פסטר זכוכית לאסוף כל עובר devitellinized צף ולהעביר אותם לצינור microfuge 1.5 מיליליטר.
הכינו את תמיסת PDMS בצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצרו צינור מאוזן על ידי הוספת כמות מתאימה של מים לצינור חרוטי שני של 50 מיליליטר. צנטריפוגו את תמיסת PDMS ב-500G למשך שלוש דקות ב-15 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ לעומק של מילימטר אחד.
אפשרו לתמיסת PDMS להתמצק במהלך הלילה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס. לאחר מיצוי לוח PDMS, הניחו שטחים מרובעים הקטנים מעט מהחלקת כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר באמצעות אזמל. בתוך כל ריבוע, הניקוד והסר היטב ריבוע ברוחב שמונה מילימטר.
העבירו היטב כל PDMS מרובע על מכסה בגודל 22 על 22 מ"מ והדביקו אותו היטב. כדי להדביק את העוברים לפתקי הכיסוי, יש למרוח מספיק 0.1% פולי-ל-ליזין כדי לכסות את משטח הכיסוי בתוך כל באר ולהניח אותם באינקובטור של 55 מעלות צלזיוס לייבוש. שטפו בקצרה את העוברים ואת PBS כדי להסיר את חומר הניקוי Tween.
לאחר מכן להעביר יותר מ -10 עוברים לתוך כל פולי-L-ליזין מצופה היטב. אפשרו לעוברים לשקוע לתחתית הבארות. הסר את עודפי הנוזל מן העוברים דבק באמצעות פיפטה פסטר ומיד להמשיך לשלב הבא.
בזמן שהעוברים יושבים בתמיסת המונומר, הכינו תמיסת ג'לציה לכיסוי בארות PDMS. לדלל את המחמצן הקטליטי טרי מהאבקה. שלב 3, 920 מיקרוליטר של תמיסת מונומר עם 60 מיקרוליטר של 10% TEMED ו 20 מיקרוליטר של 1% TEMPO.
לפצל את תמיסת הג'לציה ב 125 microliter aliquots למספר צינורות PCR. הסר את תמיסת המונומר מבארות PDMS באמצעות ואקום או פיפטר תוך זהירות שלא להפריע לעוברים. הוסף חמישה מיקרוליטרים של APS לאחד מצינורות ה- PCR המכילים תמיסת ג'לציה כדי להתחיל פילמור.
מפזרים במהירות את תמיסת הג'לציה המתפלמרת בין שלוש הבארות. חזור על פעולה זו עד שכל הבארות והעוברים מכוסים. תן את הדגימות ג'ל במשך 1.5 עד 2.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
הידרוג'לים עבים יותר ייקח זמן רב יותר להשלים פילמור ולהתמצק. להתסיס את hydrogels לעתים קרובות כדי לפקח על פילמור. לאחר שהתמצקו, הידרוג'לים לא יתנוועעו.
לאחר הג'לציה, מקלפים את בארות ה-PDMS מחליק הכיסוי מבלי להפריע להידרוג'לים. מעבירים את ההידרוג'לים בנפרד לבארות של צלחת שש בארות. ההידרוג'לים עשויים להתרחב מעט במהלך העיכול.
מכסים את הג'לים לחלוטין עם חיץ העיכול. 30 מיליליטר של חיץ העיכול מספיק כדי לכסות אותם בצלחת שש בארות לדגור אותם במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול, להעביר את הידרוג'ל לתוך צלחת פטרי שישה ס"מ ולמלא אותו עם מים deionized כדי להתרחב.
ההידרוג'לים עשויים להתנתק מחליקי הכיסוי בנקודה זו ולהתרחב ארבעה קפלים בממד ליניארי. בעזרת פיפטה של פסטר, הסירו כמה שיותר מים מצלחת הפטרי כדי למזער את תנועת הג'לים בעת הטיפול. תמרנו את הג'לים המורחבים עם העוברים על המשטח התחתון על גבי כיסוי גדול להדמיה.
יש להרכיב כל כיסוי בג'ל מעל המטרה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר. לאחר איתור הדגימות המבוימות והמכוונות כראוי עברו למטרת שמן או טבילה במים בהגדלה גבוהה לתמונה ברזולוציה גבוהה. מדידת אורך העובר לאורך ציר הראש עד הזנב תחת מטרה של פי 10 הראתה כי עוברים לא מורחבים השתרעו על פני כמחצית משדה הראייה, בעוד שהעוברים המורחבים השתרעו על פני כשני שדות ראייה מלאים.
אורך הראש לזנב הממוצע של עוברי הביקורת הבלתי מורחבים היה 398.8 מיקרומטר. בניסויים אחד, שניים ושלושה, אורכי העובר הממוצע היו גורמי התפשטות של פי 4.0, פי 4.7 ופי 4.9 בהתאמה. במדגם הבקרה, התאים בקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 4.76 מיקרומטר.
בדגימות המורחבות, התאים במקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 19.10 מיקרומטר, המייצג התפשטות של פי 4.0. שלד הציטומיוזין של האקטומיוזין צולם בבקרה לא מורחבת לעומת עוברים מורחבים, שעברו הרחבה מתכנסת. הם הופיעו כקו אחד שבו נפגשו תאים שכנים.
לעומת זאת, בשלב מורחב של שבעה עוברים, ניתן היה לראות קווים מקבילים של מיוזין 2 בצמתים של תאים, המייצגים מאגרי חלבונים בקליפת המוח בתאים סמוכים. בשלב השישי הלא מורחב, המיטוכונדריה שסומנה עם סטרפטאבידין הופיעה כאובך ציטופלזמי הטרוגני ללא פרטים תת-תאיים ברורים. עם זאת, בעוברים המורחבים, פונקטה רבים היו פתירים בתוך הציטופלסמה, ככל הנראה מייצגים מיטוכונדריה מפוצלת או חלקים של הרשת המיטוכונדריאלית.
דבר אחד חשוב לזכור כאשר מנסים הליך זה הוא להגן על העוברים מפני חשיפה מוגזמת לאור לאחר הדגירה השניונית של הנוגדנים.
