Este protocolo pode ser implementado na maioria dos laboratórios de biologia do desenvolvimento esofágico, permitindo que pesquisadores que não têm acesso a microscópios de superresolução produzam imagens de superresolução. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os pesquisadores contornem o limite de difração da microscopia confocal convencional sem a necessidade de um microscópio de super-resolução, expandindo a própria amostra. Este protocolo será benéfico para aqueles que estudam como a localização de proteínas afeta a morfologia ou função celular em embriões intactos, particularmente quando essas proteínas estão organizadas em estruturas ou redes subcelulares complexas.
O problema mais comum que as pessoas encontram é a perda de embriões ao longo do protocolo. É aconselhável aplicar várias camadas de Poli-L-lisina para aderir os embriões firmemente. Após os embriões, pegue uma base de placa de Petri plástica de seis centímetros preenchida metade com 3% de ágar.
Marque um retângulo de cinco por três centímetros no ágar com uma lâmina de barbear ou bisturi. Remova a laje de ágar usando uma pequena espátula de laboratório. Em seguida, inverta a base da placa de Petri, coloque-a no banco e coloque a laje de ágar em cima da placa invertida.
Retire a tampa da placa de Petri e certifique-se de que está seca. Usando luvas, fixe um pedaço de fita dupla face no interior da tampa. Retire os frascos para injetáveis que contêm os embriões revestidos e fixados do agitador e coloque-os verticalmente na bancada.
Permita que as fases orgânica e aquosa se separem. Embriões devidamente fixados devem permanecer em sua interface. Remova completamente a fase aquosa de fundo usando uma pipeta Pasteur e uma pipeta P200.
Use uma pipeta de vidro Pasteur equipada com um bulbo de látex para transferir os embriões fixados para uma laje de ágar em vários pequenos lotes para que eles não adiram ao interior da pipeta. Uma vez que os embriões estão na placa de ágar, use um pipetter P200 para remover qualquer heptano restante perto dos embriões. Agora, solte a tampa da fita dupla face na laje de ágar de uma altura de dois centímetros para aderir os embriões à fita.
Retire suavemente a tampa da laje de ágar, coloque-a de cabeça para baixo na bancada e adicione PBS Tween suficiente para cobrir os embriões na tampa. Para a coleta dos embriões desejados, utilizar microscópio dissecante estéreo em aumento de 100x com iluminação indireta. Pique a membrana vitelínica, perto da extremidade anterior ou posterior do embrião, com uma agulha de vidro fina para desinsuflá-la e liberar pressão.
Use pinça fina ou uma sonda de metal para empurrar suavemente o embrião para fora através do orifício com a membrana vitelínica ainda aderida à fita dupla face. Deixe embriões indesejados na fita. Use periodicamente uma pipeta de vidro Pasteur para coletar qualquer embrião desviatelinizado flutuante e movê-los para um tubo de microfuga de 1,5 mililitro.
Prepare a solução de PDMS em um tubo cônico de 50 mililitros e crie um tubo equilibrado adicionando uma quantidade adequada de água a um segundo tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a solução de PDMS a 500G durante três minutos a 15 graus Celsius. Em seguida, despeje-o em uma placa de Petri de 10 centímetros a uma profundidade de um milímetro.
Permita que a solução PDMS se solidifique durante a noite a 55 graus Celsius. Uma vez que a laje do PDMS é solidificada, marque áreas quadradas ligeiramente menores do que um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros usando um bisturi. Dentro de cada quadrado, marque e retire um poço quadrado de oito milímetros de largura.
transfira bem cada PDMS quadrado para uma tampa de 22 por 22 milímetros e adera-o firmemente. Para aderir os embriões às lamínulas de cobertura, aplique 0,1% de Poli-L-Lisina suficiente para cobrir a superfície de deslizamento da tampa dentro de cada poço e coloque-os em uma incubadora de 55 graus Celsius para secar. Enxaguar brevemente os embriões e PBS para remover o detergente Tween.
Em seguida, transfira mais de 10 embriões para cada poço revestido de Poli-L-lisina. Deixe os embriões se acomodarem no fundo dos poços. Retire o excesso de líquido dos embriões aderidos utilizando uma pipeta de Pasteur e prossiga imediatamente para o passo seguinte.
Enquanto os embriões ficam na solução de monômero, prepare uma solução de gelificação para cobrir os poços de PDMS. Diluir o oxidante catalítico na hora do pó. Combinar 3.920 microlitros de solução de monômero com 60 microlitros de 10%TEMED e 20 microlitros de 1%TEMPO.
Divida a solução de gelificação em alíquotas de 125 microlitros em vários tubos de PCR. Remova a solução de monômero dos poços PDMS usando um vácuo ou pipetter com cuidado para não interromper os embriões. Adicionar cinco microlitros de APS a um dos tubos de PCR contendo solução de gelificação para iniciar a polimerização.
Distribua rapidamente a solução de gelificação polimerizante entre os três poços. Repita até que todos os poços e embriões estejam cobertos. Deixe as amostras gelar por 1,5 a 2,5 horas a 37 graus Celsius.
Hidrogéis mais espessos levarão mais tempo para completar a polimerização e solidificar. Agitar os hidrogéis frequentemente para monitorar a polimerização. Uma vez solidificados, os hidrogéis não oscilam.
Após a gelificação, descasque os poços de PDMS da tampa sem perturbar os hidrogéis. Transfira os hidrogéis individualmente para os poços de uma placa de seis poços. Os hidrogéis podem expandir-se ligeiramente durante a digestão.
Cubra completamente os géis com tampão de digestão. 30 mililitros de tampão de digestão são suficientes para cobri-los em uma placa de seis poços e incubá-los por uma hora a 37 graus Celsius. Após a digestão, mova os hidrogéis em uma placa de Petri de seis centímetros e preencha-a com água deionizada para expandir.
Os hidrogéis podem se desprender das lamínulas da tampa neste ponto e expandir-se quatro vezes em dimensão linear. Usando uma pipeta de Pasteur, retire o máximo possível de água em excesso da placa de Petri para minimizar o movimento dos géis quando manuseados. Manobrar os géis expandidos com os embriões na superfície inferior em uma grande lamínula de cobertura para obtenção de imagens.
Monte cada tampa com gel sobre a objetiva de um microscópio confocal de varredura a laser invertido. Depois de localizar os espécimes devidamente estagiados e orientados, os espécimes mudaram para uma objetiva de imersão em óleo ou água de alta magnificação para obter imagens em alta resolução. A medição do comprimento do embrião ao longo do eixo cabeça-cauda sob uma objetiva de 10x mostrou que os embriões não expandidos abrangeram aproximadamente metade de um campo de visão, enquanto os embriões expandidos abrangeram aproximadamente dois campos de visão completos.
O comprimento médio da cabeça à cauda dos embriões controles não expandidos foi de 398,8 micrômetros. Para os experimentos um, dois e três, os comprimentos médios dos embriões foram fatores de expansão de 4,0 vezes, 4,7 vezes e 4,9 vezes, respectivamente. Na amostra controle, as células do segmento maxilar apresentaram largura média de 4,76 micrômetros.
Nas amostras expandidas, as células do segmento maxilar apresentaram largura média de 19,10 micrômetros, representando expansão de 4,0 vezes. O citoesqueleto da actomiosina foi fotografado em embriões controle não expandido versus expandido, em extensão convergente. Eles apareceram como uma única linha onde as células vizinhas se encontraram.
Em contraste, no estágio expandido sete embriões, linhas paralelas de miosina dois puderam ser observadas nas junções celulares celulares, representando pools de proteínas corticais em células adjacentes. No estágio seis embriões não expandidos, as mitocôndrias marcadas com estreptavidina apareceram como uma névoa citoplasmática heterogênea sem detalhes subcelulares claros. No entanto, nos embriões expandidos, numerosos pontos foram resolúveis dentro do citoplasma, provavelmente representando mitocôndrias fragmentadas ou porções da rede mitocondrial.
Uma coisa importante a lembrar ao tentar esse procedimento é proteger os embriões da exposição excessiva à luz após a incubação secundária de anticorpos.
